非病毒核酸递送载体平台脂质纳米粒(LNP)的介绍
随着新冠疫情的阴霾渐渐散去，各行各业也在快速苏醒恢复。在这个过程中我们已经目睹众多企业为了生存发展，主动或被动的进行变革。前瞻性的重要愈发明显，面对变革掌握着主动权无论何时都可以立于不败之地，科研亦是如此。核酸类技术开启了程序化制药的新时代，基于核酸的配对原理，科学家可以避免复杂冗长的高通量筛选而极大的推进自己的研究进程。权威机构预测继小分子和单抗药以后，RNAi可能会超过细胞疗法成为第三大药物形式，到2025年RNAi药物市场体量将迈过百亿大关。
2018年美国食品药品监督管理局(FDA)批准Alnylam公司研发的采用RNAi疗法的药物Onpattro，用于成人遗传性转甲状腺素蛋白（hATTR）淀粉样变性引起的周围神经病变。至此Onpattro正式拉开了RNAi疗法的大幕，对比化学药物RNAi药物的优势尤为明显，凭借Watson-Crick碱基配对原理，RNAi药物可以迅速识别出高活性、高亲和力和具有特异性的靶分子。面对这一巨大突破，嗅到商机的全球头部药企纷纷着手布局，开展相关研究。
回顾RNAi药物的发展， “欲戴王冠，必承其重”似乎是一个最佳的注解。头顶诺贝尔奖的光环进入大众视野，却在后续应用于临床的道路上屡屡受挫。科学界对于siRNA和miRNA的研究已经十分深入，RNAi疗法面临的挑战在于外源性的小核酸要如何进入胞内发挥作用，在进入人体后，要面临重重关卡的阻拦。肾脏的过滤清除作用、人体对于外来物质的免疫杀伤作用、体内各种酶的降解作用以及如何进入细胞核等等，说是九九八十一难也不夸张。这时候就需要一个可以保护小核酸同时可以精准定向的载体来完成转染。转染是整个核酸类技术中的关键过程，担负着从前期设计到导入目标的“转变一跃”。当今科学界公认最先进的非病毒核酸递送载体平台——脂质纳米粒（lipid nanoparticles,LNP）就是今天的主角。
Fig1：LNP的组成部分
目前FDA批准的LNP配方都含有图1所示的四种脂质，最重要的可电离阳离子脂质，以及起辅助作用的DSPC、胆固醇以及聚乙二醇脂质偶联物，这些成分可以促进单分散纳米颗粒形成，提高纳米颗粒稳定性，实现高效核酸包封，帮助细胞摄取，并促进核酸药物的内体逃逸【1】。这种复杂又特殊的结构赋予了LNP明显优于其他递送平台的特点：更强的组织穿透性，更高的转染效率和核酸包封率、更低的细胞毒性。拥有这些优势傍身，LNP成为生物界的研究热点也就不足为奇，更令人惊喜的是这位 “当红炸子鸡” 没有故步自封，在扩展研究方向和作用的路上高歌猛进。
Nature杂志在其官方发布的“2022年值得关注的七项技术”中为LNP保留了位置，与基因编辑和量子计算等前沿技术同列。前文提到的全球首个RNAi药物Onpattro采用的给药系统就是LNP导入技术，19个碱基对的siRNA被包裹在LNP中通过药物输注直接运输到肝脏，阻止甲状腺转运蛋白（TTR）的异常表达，从而减少外周神经系统中淀粉样蛋白的沉积【2】。LNP已经实现肝脏的运输，但是各种疾病的病灶和靶细胞却不会仅局限于肝脏，为了实现LNP的定向运输，乔治亚理工学院的J. E. Dahlman教授团队从T细胞会主动吞噬脂蛋白颗粒和包膜病毒这一现象得到灵感。参考与LNP类似的结构，猜测缺乏靶向配体的LNP可以在体内将RNA传递给T细胞。研究小组发现含有构象受约束的脂质的纳米材料形成稳定的LNP，命名为受约束的脂质纳米颗粒（cLNP）。cLNP以低至0.5 mg kg-1的剂量向T细胞递送siRNA和sgRNA【3】。
Fig2：用于体内活性的高通量siRNA筛选显示，cLNP在T细胞中具有生物活性
第一代脂库的筛选结果提供了初步的证据，即含金刚烷的LNP可以在不使用靶向配体的情况下将核酸siRNA体内递送至T细胞。为了进一步研究金刚烷与siRNA传递之间的关系，研究人员用含金刚烷的LNP进行了第二次体内筛选。最终的结果说明了cLNP不优先靶向肝细胞，递送的方向与化学成分和载体尺寸相关。这一发现颠覆了之前对于LNP递送的固有认识，科研小组也表示希望他们的研究成果科研激发其他的发现和突破。Dahlman教授的期望没有落空。塔夫茨大学的实验室使用基因文库进行筛选发现脂质纳米颗粒的器官靶向性是由脂质化合物的连接基团决定的，需要靶向肝脏就选择连接基团为酯键的O系列；如果需要靶向肺部就选择连接基团为酰胺键的N系列。
Fig3：观察不同靶细胞的转染情况
同时使用液相色谱-质谱分析了肝和肺靶向LNPs上的蛋白冠，并鉴定了一组独特的血浆蛋白，这些蛋白质特异性地吸附在表面，可能有助于这些LNPs的靶向性。通过简单地调整N系列LNPs的头部结构，也可以靶向不同的肺细胞类型【4】。基因疗法面对的一大挑战就是如何做到安全高效的靶器官和靶细胞的定向运输，围绕LNP的这些研究成果为苦心钻研的科学家指明了方向。
RNAi疗法历经波折，从横空出世到沉寂谷底，又到今天的如日中天。这翻天覆地的变化完全仰赖于Alnylam研发的Onpattro成功上市，精心修饰后的siRNA搭配先进的LNP递送系统强强联手，挽救了被各大药企抛弃的RNAi领域。小核酸药物的优势在高特异性，广泛的靶点以及可观的半衰期。LNP脱胎于脂质体，经过20多年的发展，已经成为最先进的非病毒核酸递送载体平台。利用自身优势一次又一次突破生物研究的瓶颈，我们有理由相信LNP与RNAi的组合会给我们带来一个又一个研究上的突破和惊喜。
同立海源生物自成立一直专注于细胞与基因治疗（CGT）上游GMP级核心试剂原料和研发生产，公司研发生产的LipidnanoTM Super RNAi 转染试剂（货号：TL-1001）独具核心竞争力，转染效率高、低细胞毒性、操作简单快捷，并可实现体内外同机制一体化转染。该款转染试剂用于 siRNA 介导的基因敲低实验，适合将 siRNA 和 miRNA 等小RNA 高效地输送到广泛的细胞类型中。试剂包载核酸效率优异，通过提升细胞内吞后包载核酸的内含体逃逸水平，促进 siRNA 在细胞质内发挥 RNA 干扰作用。
操作流程
解读文献：
【1】 Hald Albertsen C, Kulkarni JA, Witzigmann D, Lind M, Petersson K, Simonsen JB. The role of lipid components in lipid nanoparticles for vaccines and gene therapy. Adv Drug Deliv Rev. 2022 Sep;188:114416.
【2】 Hu B, Zhong L, Weng Y, Peng L, Huang Y, Zhao Y, Liang XJ. Therapeutic siRNA: state of the art. Signal Transduct Target Ther. 2020 Jun 19;5(1):101.
【3】 Lokugamage MP, Sago CD, Gan Z, Krupczak BR, Dahlman JE. Constrained Nanoparticles Deliver siRNA and sgRNA to T Cells In Vivo without Targeting Ligands. Adv Mater. 2019 Oct;31(41):e1902251.
【4】 Qiu M, Tang Y, Chen J, Muriph R, Ye Z, Huang C, Evans J, Henske EP, Xu Q. Lung-selective mRNA delivery of synthetic lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary lymphangioleiomyomatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Feb 22;119(8):e2116271119.
