生物反应器在生物工程肝脏器官体外培养研究中的应用

急性和慢性肝功能衰竭肝脏移植是唯一治疗方法，供体器官却面临持续短缺的情况。器官生物工程技术有希望利用生物反应器体外培养制造人体器官来解决这一困境。然而，该技术在临床上的应用目前还受到功能血管网络重建、特定功能细胞移植、细胞系培养条件不同等重重阻碍。
 

Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs报告了一种将HUVECs（人脐静脉内皮细胞）重新内皮化后，原代猪肝细胞植入生物工程肝脏（BEL）支架，利用生物反应器进行体外培养增殖器官细胞获得生物工程肝脏的方法。

去细胞支架制备

首先，使用Triton X-100和SDS洗涤剂溶液分别灌注猪肝脏以获得无细胞支架。组织学染色验证去细胞化支架中完全去除细胞物质并只保留细胞外基质（ECM）蛋白胶原I和胶原IV。随即将去细胞化的肝脏安装在生物反应器中，并用不含抗生素的内皮培养基灌注72小时（37°C，5%二氧化碳）。
 

人脐静脉内皮细胞培养与支架接种

人脐静脉内皮细胞同样在不含抗生素内皮细胞生长培养基中进行预处理（37°C，5%二氧化碳），随即接种进行培养。首先静态培养1小时，使得细胞先附着在支架上，随后灌注补充含青霉素和链霉素的培养基。每天更换培养基，确保生物反应器内葡萄糖水平在24小时内保持在0.3 g/L以上。培养过程中培养基灌注压力保持在12 mmHg。

猪肝细胞分离、培养与支架接种

新鲜猪肝脏去除残留血液和经缺血性损伤预防性处理后，使用胶原酶和中性蛋白酶进行酶解。使用含10% FBS（胎牛血清）的Williams E溶液进行细胞分散，经过筛分离、离心富集得到肝细胞，并在2L培养基中进行高密度培养（1X10⁶细胞/mL）。HUVEC接种至支架的13-16天后，以50 mL/min的速率利用蠕动泵将含有肝细胞的培养基灌注至反应器内。接种48h后，观察到肝细胞在支架上呈簇状分布。

反应器培养细胞代谢物与分泌因子分析

每天收集来自生物反应器的培养基样品，进行离线分析确定培养基中葡萄糖，氨和乳酸脱氢酶活性的水平。测量葡萄糖浓度用于计算24小时内的消耗。使用ELISA试剂盒定量可溶性和白蛋白。
 

经组织学分析、氨清除动力学分析和尿素生产测定后，证实培养所得到的生物工程肝脏能够产生白蛋白、氨解毒和尿素合成，具有肝脏器官类似的功能。实验证实了肝细胞高密度培养的可行性，并在去细胞化肝支架中可以保持其器官功能。此外，数据显示在支架中培养的内皮细胞在体外不会阻碍支架中肝细胞的功能。

生物工程肝脏还可以用于减缓手术诱导的急性肝功能衰竭模型中氨的积累。该研究结果证实了设计生产临床规模BEL可行性，并建立了一个优化肝脏特异性细胞接种和植入的生物培养平台。

参考文献：

1. Anderson, B.D., Nelson, E.D., Joo, D. et al. Functional characterization of a bioengineered liver after heterotopic implantation in pigs. Commun Biol 4, 1157 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-02665-2