实时荧光定量PCR检测支原体步骤介绍

荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR)是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种核酸新定量试验技术，荧光定量PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。在实时荧光定量PCR技术中Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

实时荧光定量PCR检测支原体主要的步骤包括支原体特异引物和探针的设计，阳性标准品的制备及标准曲线的绘制，荧光定量PCR特异性实验，敏感性实验和重复性实验，最后是用待测细胞上清液上机检测，通过Ct值及扩增曲线判断。随着实时荧光定量PCR的使用，出现了很多利用此技术检测支原体的研究，Lorenzon S等利用荧光定量PCR方法检测肺炎支原体capripneumoniae等，2017年Gerlier等发明了利用荧光定量PCR检测支原体的专利。实时荧光定量PCR简化了操作步骤，采用闭管检测可避免PCR跑胶导致的气溶胶假阳性的出现，敏感性高，可以实现实时监控，还可以实现定量判断。实时荧光定量PCR具有比PCR检测快，灵敏度高的优势，尤其适合样品模板含量较低时使用，实时荧光定量PCR能通过溶解曲线能够判断特异性扩增。实时荧光定量PCR需要配套价格高昂的荧光定量PCR仪器，而且设备维护费用高，机器设置操作复杂，需专业人员，难以得到全面推广。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是一种新兴的基因扩增技术，由日本学者Notomi 2000年在Nucleic AcidsRes杂志上公开发表，作为一种分子生物学检测技术，现先已广泛应用于分子检测领域，2005年Saito R等人发表了LAMP法快速检测肺炎支原体的文章。2014年HEYing等用LAMP方法快速检测capripneumoniae支原体，2016年美国Jonas M等发明了利用LAMP方法检测肺炎支原体的专利。 2016年曹振发明了一种检测广谱支原体的LAMP方法的专利。2017年Matsuzaki I等使用LAMP用于基因转移的快速检测。LAMP原理是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(如Bst 酶)的作用下，水浴锅中63℃左右，60分钟即可实现109～1010倍的核酸扩增，具有很高的扩增效率，操作简单，检测不需要使用特殊的仪器。LAMP虽然增加了扩增效率，但引物间的非特异性配对容易导致假阳性结果，限制了LAMP方法的使用。

由于实时荧光定量PCR需要配套的仪器，且操作复杂，需要有经验的实验人员对检测结果进行分析，而LAMP法会出现假阳性问题，使实时荧光定量PCR和LAMP法在检测支原体污染上都存在一定的弊端，为了寻求一种使用简单，结果准确支原体检测方法，出现了利用支原体酶这一特定活性检测支原体的ATP酶法，如Lonza公司推出的商品化的Mycoalert支原体检测试剂盒，ATP酶法是采用生物发光的原理，检测支原体酶活性，其检测的支原体酶广泛存在于180多种支原体中，而这种酶不存在于真核细胞中。当支原体被裂解后，释放的酶与反应底物发生催化反应，将ADP转化成ATP，通过荧光分光光度计测量样品中添加底物前后ATP的含量，可以得到一个比率，该比率指示支原体是否存在。如果这些酶不存在，第二次读数相对于第一次读数就没有增加，如果酶与底物进行特异性反应，就会导致ATP含量上升。ATP含量的上升通过生物发光化学反应可以检测到，读数上升表明存在支原体污染。