比率成像显微镜Inscoper liveRATIO在监测T细胞活化的应用

当受到环境刺激时，许多细胞类型使用钙信号进行细胞内信息处理并通过激活特定基因表达程序来诱导适当的生物反应。例如，钙瞬变负责免疫细胞的激活。在本应用说明中，我们将对 γδ T 细胞中的钙瞬变进行成像，以表征它们在磷酸化抗原呈递后的活化。所有这些实验都是使用 Inscoper liveRATIO 实现的，这是一种为比率成像量身定制的解决方案。

T淋巴细胞中的钙信号
从细胞外到细胞内的信号转导由第二信使介导。这些细胞信号传导的关键参与者可能是核苷酸、脂质、自由基或离子。它们都与特定目标结合以诱导具有特异性的下游信号。例如，离子具有在信号诱导后诱导快速响应的特性。钙是一种普遍存在的次级信使，可调节多种途径，如细胞存活、增殖、激活、神经发生、细胞运动、肌肉收缩或神经元突触传递（Paemeleire 等人，2000 年； 贝里奇等人，2000，2003; 克拉彭，2007；格林伯格和康纳思，2012； 休莫等人，2018；Zumerle 等人，2019 年）。
 
钙在 T 细胞的活化中起主要作用。这些淋巴细胞是一类在适应性免疫反应中发挥重要作用的白细胞，具有在其表面呈递 T 细胞受体 (TCR) 以检测抗原存在的特殊性。在基础条件下，静息淋巴细胞维持细胞内低浓度的钙（维格和基内特，2009 年）。然而，TCR 对抗原的识别会诱导其活化，其特征是细胞内钙水平的快速增加。
 
激活的 T 细胞然后能够根据其类型参与免疫反应：细胞毒性 T (CD8+) 细胞破坏受感染的细胞/病原体，辅助 T (CD4+) 细胞激活其他免疫因子，调节性 T 细胞 (Treg) 阻止激活在自身免疫淋巴细胞中，自然杀伤 T 细胞 (NKT) 分泌细胞因子并裂解抗原靶点。
其他一些 T 细胞被认为是“非常规的”，如 MAIT 或 γδ T 细胞。所有这些细胞类型的协调对于免疫反应的成功是必要的。
 
淋巴细胞是免疫防御机制的核心组成部分。它们的激活是免疫反应所需的关键步骤之一。可以使用比率成像监测钙瞬变来探索这种复杂的生理现象（巴拉戈帕兰等人， 2011). 这项技术可以为研究人员提供一种提高对免疫细胞激活的理解和探索病理生理障碍的方法

INSCOPER LIVERATIO，比例成像的现代多功能解决方案
Inscoper liveRATIO 是用于比率成像的完整显微镜解决方案。该产品由与生命科学中使用的高级视频显微镜兼容的软件和硬件包组成（图 1）
  图 2：配备 Inscoper liveRATIO 的钙比率成像实验装置

钙瞬变的比例成像​
目标：
在这里，我们想要表征磷酸抗原呈递后 γδ T 细胞的激活。为此，我们将监测淋巴细胞中的钙瞬变。
 
材料：
该实验是与显微镜设备 MicroPICell（法国南特）合作实现的。使用配备 HC Plan Apo 20x 0.70 NA（506166；Leica）的 Leica DMI 6000B 显微镜（Leica，Wetzlar，Germany）（图 2）。对于这个实验，相机是数字 CMOS Orca Flash 4.0（C11440；Hamamatsu Photonics，Hamamatsu，日本），光引擎来自 CoolLED（pE-800富拉；CoolLED，Andover，UK）。使用 Inscoper liveRATIO (INSCOPER, Cesson-Sévigné, France) 进行显微镜控制、采集和实时图像处理。
 
方法：
γδ T 细胞用 Fura-2 AM（F1201；Thermofisher，Waktham，MA，USA）标记，这是一种对游离细胞内钙具有高亲和力的荧光探针。其在低钙浓度（最大激发 = 362 nm，最大发射 = 512 nm）下的光谱特性与高钙条件（最大激发 = 335 nm，最大发射 = 505 nm）下的光谱特性不同。 340nm 和 380nm 的激发可以分别用钙结合和游离荧光探针成像。在采集过程中，将磷酸化抗原手动添加到淋巴细胞培养基中，并监测荧光。使用 DMSO（用于 Fura-2 稀释）作为阴性对照也进行了相同的实验。
结果：
许多染料根据其特性（结合钙或在质膜上被动扩散的能力、激发/发射波长、强度、亮度和稳定性）用于进行钙成像。此外，可以使用非比率（更方便和更快，但不适合量化）或比率方法（更复杂但完全适合定量测量）进行成像。