ibidi µ-Patterns 上细胞粘附的实验参数和优化操作讲解

本应用说明讨论了对于细胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要实验参数。此外，它还解释了如何优化细胞粘附和模式覆盖。

关键词

· µ-Patterning、粘附、结合基序、单细胞模式、多细胞微模式、细胞培养、粘附细胞

细胞类型

ibidi µ-Patterning 的成功实验仅限于贴壁细胞类型——悬浮细胞不能附着在图案表面。此外，对 µ-Pattern 表面的粘附高度依赖于细胞类型，因为并非所有细胞类型都与所有结合基序结合。因此，在开始实验之前，有必要测试所选细胞类型是否能够粘附在图案表面上。

 

结合基序

ibidi µ-Patterning 技术为细胞粘附提供共价结合的结合基序。这些结合基序的表面密度可能不同于经典的蛋白质涂层。因此，结合基序可能导致细胞形态或粘附行为的改变。测试您的细胞是否与结合基序兼容的最佳方法是将它们接种在具有大粘合面积的图案点上（例如，多细胞图案）。验证单元格兼容性后，您可以切换到更小的模式，例如单单元格模式。

 

几何图案

由于结合基序的数量，图案几何形状会影响细胞的粘附行为。例如，较小的形状呈现较少的结合基序，与较大的形状相比，这可能会降低细胞粘附。特别是对于单细胞实验，需要在图案上实现单细胞占有率，图案尺寸非常重要，因为太小的图案阻碍了适当的细胞粘附和扩散，而太大的图案会导致多个细胞粘附在一个单点。此外，当所用细胞类型的间距太小时，粘附斑块之间的间距会影响理想的细胞接种浓度和细胞从一个点到另一个点的桥接。

细胞接种浓度

接种浓度是优化粘附过程的另一个关键参数。较低的浓度会导致图案上的细胞较少，或者只有稀疏占据的斑点，但结块较少。较高的细胞浓度可以提高细胞覆盖率，但要承担 a) 结块和 b) 在单细胞粘附位点上出现多个细胞的风险。如果细胞浓度太高并且细胞在附着到粘附点之前开始聚集，这些漂浮的聚集体可能会从模式中分离粘附细胞并阻止进一步的细胞粘附。

 

细胞悬液质量

细胞悬液的均匀性高度影响实验输出。没有任何细胞聚集体的单细胞悬浮液非常适合单细胞检测。接种细胞簇或球体悬浮液是 3D多细胞检测的一种选择。

 

培养时间

接种细胞后的孵育时间会影响粘附过程。与其他表面相比，细胞附着在图案上所需的时间可能不同。在粘合过程中移动 µ-Patterned 载玻片时要特别小心。未连接或仅松散连接的细胞可能会开始结块。

 

机械应力和洗涤

部分附着的细胞可能会被机械力冲走。利用这种效果有助于去除细胞或碎片。根据洗涤步骤的强度（剪切应力），可能会从表面洗掉更多或更少的细胞。

 

细胞适合度

细胞的活力和适应性是适当细胞粘附的重要因素。因此，请确保优化细胞制备过程，以最大限度地减少细胞压力。优化和标准化影响细胞健康的因素，例如化学分离、温度、机械应力、悬浮时间、培养基成分和其他细胞培养参数。

优化 µ-Pattern 上的细胞粘附

 

 

初步测试：细胞类型是否与 µ-Pattern 兼容？

 

如果您不知道您的细胞类型是否与 µ-Patterning 的结合基序兼容，我们建议首先在多细胞 µ-Pattern 上运行初始细胞粘附测试。在较大图案上测试粘附减少了对结合基序本身的初始兼容性测试，同时排除了单细胞和图案几何效应。

· 按照说明中的协议使用 2-3 种不同的细胞接种浓度，并通过将它们孵育至少 4 小时直至过夜，让细胞不受干扰地粘附。

· 在洗掉未附着的细胞之前, 用相差显微镜控制细胞附着。拍摄细胞图像总是有助于随后优化过程。

· 洗涤后至少 2 小时拍摄额外的图像，让细胞有时间从洗涤时经历的剪切应力中恢复。

请注意：在此阶段，不需要最佳模式覆盖。任何细胞都坚持该模式是很重要的。如果是这种情况，您可以继续优化所需模式的播种参数。如果您在孵育过夜后仍未在图案上看到任何细胞附着，则您的细胞类型可能与所使用的结合基序不兼容。

优化附着在 µ-Pattern 上的细胞的播种参数

 

如果您知道细胞与 µ-Pattern 的结合基序结合，则可以开始优化所需模式上的细胞接种参数。请考虑每个模式都需要针对您的特定细胞类型进行优化，因为模式大小和模式之间的距离在很大程度上影响播种参数。确保细胞至关重要，并且您有单细胞悬液。

 

第一次优化运行

· 按照说明在载玻片上接种至少三种不同浓度的细胞。

· 让细胞在洗涤前无干扰地粘附至少 4 小时。

· 在洗涤前和洗涤后至少 2 小时拍摄细胞图像。

 

可能的结果和故障排除

 

– 洗涤后，细胞很好地固定在图案上，图案覆盖度很好。

您已经为您的实验找到了合适的播种参数。您可以使用相同的条件开始您的实验。

 

– 洗涤前，只有少数细胞漂浮和聚集。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。

细胞密度可能太低。在洗去未附着的细胞之前，尝试更高的接种浓度并考虑更长的孵育时间。

 

– 在洗涤之前，有很多漂浮的、聚集的细胞。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。

细胞密度可能太高。尝试降低初始接种浓度，因为过高的细胞密度通常会导致细胞聚集，阻碍细胞与模式结合。此外，在播种后 2 小时和 3 小时检查细胞，看看更短的孵化时间是否会导致更少的聚集，从而更好地覆盖模式。

 

– 洗涤后，图案上会出现不需要的细胞聚集。

这表明初始接种浓度太高/或洗涤前孵育时间太长。尝试较低的接种浓度，并在 2 小时和 3 小时后检查细胞，看看较短的孵育时间是否足以使细胞粘附良好。

 

– 当使用小的单细胞斑点或细线时，图案上没有细胞粘附或细胞呈圆形且不会扩散。

如果您从之前的实验中知道细胞可以与所使用的图案结合基序结合，则图案尺寸对于您的细胞类型来说可能太小，并且细胞没有足够的空间来正确传播和粘附。因此，为您的实验使用更大的图案尺寸。

 

第二次优化运行

· 如上所述，根据第一次优化运行的结果使用优化的细胞培养参数。

将您的结果与第一次优化运行进行比较，如有必要，进入另一轮优化。

示例图像

图1，L929 细胞不同接种浓度对单个细胞模式的影响。(A) 将细胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。在低接种密度下，许多点没有被任何细胞覆盖。然而，在太高的接种浓度下，细胞开始在图案上聚集。

 

 

图 2：不同图案孔大小对 Rat1 细胞在单个细胞图案上的传播行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 9*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 Rat1 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以在图案上展平。

 

图 3：不同图案几何形状对 NIH3T3 细胞在单个细胞图案上的扩散行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 3* 10 5 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 NIH3T3 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以使其在图案上变平。然而，由于图案边缘之间的距离小了 10 µm，细胞能够从一个点连接到另一个点。对于该细胞系，需要更大的图案之间的距离。

 

对以上ibidi方案产品感兴趣，可在公众号申请免费试用装

广州科适特科学仪器有限公司是德国ibidi公司在中国区合作伙伴

如果你感兴趣请和我们联系

电话：020-38102730  

服务QQ：501747125

邮箱：info@kosterscience.com

地址：广州市天河区体育西路骏汇大厦北塔140 B/D房

关注微信公众号及时获取最新资讯