耐药突变事件逐年增加，新的乙肝耐药突变模式被证实

恩替卡韦、替诺福韦和丙酚替诺福韦（ETV、TDF和TAF）是2019版中华医学会的《慢性乙型肝炎防治指南》推荐乙肝患者首选的强效低耐药药，随着ETV大量使用，在真实世界中耐药发生情况到底是怎样的呢？我们通过对5篇乙肝耐药相关文献的解读，研究真实世界的耐药发生情况和特点。文献解读的上篇我们分析了302医院8年的耐药数据和北京佑安医院8年大数据，两组数据都显示ETV耐药检出率逐年提升。本期我们带来一组新数据，继续研究ETV的耐药发生率和新的耐药突变形式。

文章收集了自2011年至2017年的持续HBV病毒血症（抗病毒治疗48周后，血清的HBV DNA持续大于100IU/ml）或者发生病毒学突破患者；使用测序方法学进行耐药检测，检测出L180M+M204V/I±rtT184A/C/F/G/I/L/S±rtS202G±rtM250L/V判定为ETV基因型的耐药位点。^[3]

本研究共筛选到72例ETV耐药案例，统计发现，在所有耐药案例中ETV的耐药所占比例从2011年的6.04%上升至2017年的15.02%。

随着临床上ETV耐药患者逐年增加，耐药变异形式变的复杂多样，除了经典的耐药变异形式，不断有新的新ETV耐药变异体产生。2015 年日本学者在Journal of Hepatology 上首次报道在1 例ETV治疗失败患者检出一种新型ETV耐药突变rtL180M+A186T+M204V。

本研究共纳入12708例慢性乙型肝炎患者，4047例(31.85%)有ETV用药史，直接测序法检出795例发生经典ETV耐药，分别占总人数和ETV用药人数的6.26%(795/12708)和19.64%(795/4047)，其中7例(0.06%)检出rtA186T突变，占ETV治疗患者的0.17%(7/4047)。
 

文章对HBVrtA186T突变株的复制力和药物敏感性进行了分析，病毒复制力检测显示，rtL180M+A186T+M204V突变株的复制力显著低于野生株，仅为野生株的13.3%(P<0.05)；耐药表型分析结果显示，rtL180M+A186T+M204V突变株对ETV的耐药倍数是野生株的210.2倍。(EC50比值为0.14/0.000666，图2A)，但对TDF仍敏感，EC50比值为1.76倍(3.83/2.17，图2B)。^[4]

本研究通过分析临床大样本数据和体外实验证明，rtL180M+A186T+M204V为ETV的一种新型耐药突变，但临床检出率低，与突变株复制力明显降低相关。

本研究统计到发生ETV的耐药总检出率为5.69% (1,252/22,009)，在具有ETV的服药史或暴露史患者中检出率为20.29%(1,252/6,170)；这1,252例患者中只有17例患者没有其他NAs药物的暴露史，如LAM和LdT。通过序列分型共有18例患者血清中检测出A181C的突变，在总患者人群和ETV用药史人群中的比率为0.08%和.29%。

对5名具有A181C患者治疗过程中随访时各个时间点的血清样本的各个指标分析，ETV治疗阶段病毒学突破时耐药检测均检出了不同比率的A181C的突变株。^[5]

文章对含有A18C的突变株进行复制能力和耐药性进行体外实验。相对于野生型相比，rtL180M + A181C + M204V, rtL180M +A181C + M204V + M250V和rtL180M+ A181C + S202G + M204V突变体是野生型复制能力的45.7%,25.9%,和25.0%，而对ETV的易感性分别下降85.6，356.1和307.1倍，当人为清除rtA181C的突变体时很大程度恢复rtL180M+A181C+M204V突变体对ETV的敏感性。EC50实验显示，与野生型相比，突变体EC50增加了70.5倍，这表示相对野生型增加了70.5倍的耐药性。文章通过分析病毒RT区与ETV结合的分子模型显示，rtL180M+A181C+M204V突变体表现出较rtL180M+M204V突变体更加不稳定结构。

本研究通过临床表现、测序分析和体外实验显示rtL180M + A181C + M204V是一种新型非经典的ETV耐药突变形式。

基于以上研究显示，ETV的真实世界耐药检出率在逐年提升，在近几年总耐药患者中接近达到20%的耐药患者与ETV相关；这与目前ETV的逐渐大量使用以及国内有大量既往低耐药屏障的药物LAM、LdT患者群体存在相关联，这一比例随着ETV的更多使用会进一步加大。这提示，随着一线药物在临床治疗上大量使用，真实世界的耐药事件会逐渐增多，需加以关注；尤其是对于具有联合用药史、不明用药史和既往低耐药屏障服药史患者加以耐药监测，避免因耐药导致疾病进一步进展。同时，最近的一些研究显示不断有的ETV的耐药突变形式出现并证实。耐药检测的测序法是最好的方法用于耐药检测，其具有检测精准和位点全面的优点，能够精准的检测出指南中经典的多个耐药位点，同时还可以检测出对于新出现的位点。

参考文献

1、 Jin S, et al. Efficacy of DifferentNucleoside Analog Rescue Therapies for Entecavir-Resistant Chronic Hepatitis BPatients, [J]. BMC Infectious Diseases, Preprint 2020 Version 2,  DOI:10.21203/rs.3.rs-64765/v2

2、刘璐洁,等. 乙型肝炎病毒新型恩替卡韦耐药突变rtL180M+A186T+M204V 的鉴定, [J]. Med J Chin PLA,2019, 44(3): 197-202.

3、  Zhou Y, Liu Y, Chen R, et al. HBVrtL180M+A181C+M204V mutations may lead to entecavir resistance in real-lifeclinical practice[ J]. Hepatology, 2017, 66(1 Suppl): 505A.

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• 检测常见的YMDD突变M204V/I，也可以同时获得RT逆转录区的其他多个耐药突变位点，包括有文献支持的A181V/T，N236T，I169T，L180M，T184A/G/S/I/L/F，S202G/I，M250V/L/I，V173L，A194T，对未知耐药位点和发生变异的病毒有很好的临床和科研参考价值
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