GEN eBook | 病毒学/病毒免疫学最新研究与开发策略

GEN eBook包含一系列文章和研究，重点关注创新的研究和开发策略，让科学家们能够充分利用新方法和获得的新见解，解决病毒生物学的复杂问题，从而加快发现和开发抗病毒感染新疫苗的速度。
 
   
·  流感疫苗可预防患有镰刀形细胞症小鼠的H1N1感染
·  细胞系中的微粒释放及其抗流感活性
·  接受肾透析的HIV阳性患者在接种水痘-带状疱疹病毒疫苗后的血清学和T细胞反应
·  使用新型多重T细胞活化试验进行的激酶抑制剂表型筛选
·  对四价丙型肝炎病毒样颗粒疫苗佐以Toll样受体2型激动剂的抗体应答
自身免疫性疾病的一个主要原因是某些干扰导致TCR信号增强和T细胞过度激活。例如，一些遗传缺陷、突变和其他机制导致T细胞激酶活性增强，从而参与许多自身免疫病的病理发生，使它们成为有吸引力的T细胞活化抑制剂靶点。
 
目前，FDA批准的激酶抑制剂（KI）有37种，主要用于肿瘤治疗，此外约有250种正在临床试验中。专门针对T细胞激活早期信号事件的KI药物，已成为治疗自身免疫性疾病的新焦点，最近FDA已批准KI治疗类风湿性关节炎。
 
在开发调节TCR活性的药物和疗法时，需要对细胞功能和健康进行分析。为了满足快速监测T细胞功能的需要，我们采用高通量流式细胞术开发了一种优化的、高内涵的、多重性检测方法来分析T细胞激活，可用于同时评估T细胞表型、T细胞激活标记物、细胞增殖、细胞活力及其分泌的细胞因子定量，并适用于96孔或384孔板的高通量筛选需求。
  采用这种方法快速筛选了152个KI小分子，以验证其对人原代T细胞激活的抑制能力。样本来自人外周血PBMC，采用抗CD3/CD28微球刺激。
  在基于流式细胞术的筛选中，我们将以下检测在一次实验中完成，节省时间，同时获得丰富的样本信息，以便做出综合性决策：
 

• 检测T细胞活化早、中、晚期的活化标志，分别是CD69、CD25和HLA-DR
• 评估CD4和CD8细胞的增殖水平
• 分析CD4和CD8细胞的活性
• 定量细胞分泌的多种细胞因子，以评估T细胞功能

 
我们将这些分析的指标作为小分子库的筛选标准，用系统内置的筛选工具（Profile Map）进行筛选。
如下图所示，左边面板（图A）显示了筛选中整合的11个参数，及每个指标的用户定义阈值。
 
通过这种筛选方法，我们鉴定出27种不同的KI，它们抑制所有的T细胞激活标记物及细胞因子分泌（如图B所示）。
   图C的折线图对所有hits命中和抑制程度进行了排序，对每个指标提供了简单的可视化呈现。例如，一些KI处理完全抑制所有激活标志，而其他化合物对某些特定的表型标志或细胞因子影响更大。
 
此外，本次实验还用不同浓度的化合物（20uM - 20nM）处理细胞，以获得抑制浓度曲线及IC50。这些数据显示这些KI具有不同的MOA特性。
  这种基于流式细胞术的高通量筛选方法，既可用于抗体和小分子开发流程中的初筛，也可用于二次表型筛选。此外，T细胞活化和细胞因子检测还可用于肿瘤免疫学领域的功能研究，对细胞制造过程中的T细胞进行表征。