UHPLC和高分辨率台式质谱仪联用分析霉酚酸酯的降解产物
前言
强制降解实验能揭示各种环境因素对原料药和制剂的影响。它能提供药品安全信息、确定推荐储存条件、保质期和分析方法的特异性。而降解产物的信息能帮助改进化合物或配方的发展。
霉酚酸酯（MMF）的商标名称为骁悉（CellCept），是一种免疫抑制剂和霉酚酸（MPA）的前体药物。 MMF 广
泛的应用在治疗器官移植排异反应和自体免疫疾病的移植药物中。本研究选择 MMF 作为模型化合物。
本文开发了一种快速可靠的分析霉酚酸酯降解产物的完整工作流程，使用的仪器是赛默飞世尔科技的 AccelaTM
UHPLC 系统和台式 Orbitrap Q Exactive FocusTM 质谱仪，数据处理采用 Mass FrontierTM 软件。霉酚酸酯在热和过氧化物催化下的降解研究的 pH 值设定为 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2。采用 HRAM 全扫描和数据依赖MS/MS 在高分辨率和极性切换模式下实现降解产物的快速鉴定。 HRAM MS 和 MS/MS 谱图以及正 / 负离子模式切换，能可靠完成降解产物的定性和结构鉴定。
实验方法
材料与试剂
霉酚酸酯 API CAS# 128794-94-5 购自 2A PharmaChem（Lisle， IL），纯度 >98%。
霉酚酸酯降解产物标准品
霉酚酸， CAS# 24280-93-1 Sigma-Aldrich。
霉酚酸酯杂质 G， CAS# 224052-51-1， Molcan Corporation，加拿大多伦多
霉酚酸酯杂质 A， CAS# 1322681-36-6， Molcan Corporation，加拿大多伦多
盐酸、乙酸铵、氢氧化钠和过氧化氢购自 Sigma-Aldrich。
样品前处理
● 霉酚酸酯储备液，浓度为 2.5 mg/mL 的乙腈溶液，称取 25 mg 标准品配制在 10 mL 乙腈中。
● 盐酸（0.01 N， pH 2），乙酸铵（5 mM， pH 6），氢氧化钠（0.01 N， pH 8）和过氧化氢（3%， pH 8.2）。购买的 30% 过氧化氢用水稀释 10 倍后用于酸、碱和氧化研究。用氢氧化铵或乙酸调节强制降解溶液 pH 值。
● 用如上 pH 2、 pH 6、 pH 8 的溶液和过氧化氢（3%， pH 8.2）将浓度为 2.5 mg/mL 的霉酚酸酯储备液稀释 10倍配制浓度为 0.25 mg/mL 的强制降解溶液。强制降解溶液放置于 60℃烘箱中。在放置的第 1、 20、 48 和 72小时分别取样，直接进样到 LC/MS 中进行分析。
HPLC 方法
HPLC 系统： Thermo Scientific Accela 1250 pump, Open Accela Autosampler and Accela PDA
色谱柱： Thermo Scientific Dionex Acclaim 2.1×150 柱 , 2.2 μm
柱温箱温度： 35℃
流动相：A - 0.1% 甲酸水溶液
B – 含 0.1% 甲酸的乙腈
C - 100 mM 甲酸铵的水溶液（pH 5）
梯度洗脱： 0-0.5 min 保持 20% B，然后在 15 min 内线性增加到 40%B
流速： 500 μL/min
进样体积： 1 μL
质谱方法
质谱仪： Thermo Scientific Q Exactive Focus 台式高分辨质谱
仪，配备 HESI-II 离子源
离子化模式： ESI 正 / 负离子切换
全扫描采集： m/z 120-1000 amu，分辨率为 70,000（FMHW@m/z 200）
MS/MS 采集： 35,000 分辨率下响应强度数据依赖采集
HCD 碰撞能量： 35%， 25% 阶梯变化
结果与讨论
I. UHPLC- 高分辨率 MS 快速测定降解产物
采用 UHPLC- 高分辨率 MS 快速分析降解产物。高质量的 HRMS 全扫描图谱为测定降解产物的元素组成提
供了重要信息，并从随后的数据依赖 MS/MS 获得分子离子的裂解信息。
II. 高分辨率 MS/MS 鉴定降解产物的结构
具备阶梯式碰撞能量的高分辨高能碰撞解离功能产生了信息量丰富的碎片，能更轻松地完成降解产物的结构鉴定。
III. 极性切换功能全面鉴定降解产物
快速正 / 负离子切换实验采用在正离子模式下完成一次全扫描，然后进行数据依赖 MS2 HCD 裂解。随后转换到负离子模式下进行全扫描和数据依赖 MS2 HCD 裂解。自动极性切换提供了不同但是互为补充的降解产物的裂解信息。这些独特极性的碎片能帮助确认结构鉴定结果（图 6）。
结论
本文研究了霉酚酸酯 API 在 pH 2.0、 3.5、 6.0 和 8.2 条件下的热和过氧化氢降解。采用台式高分辨率质谱仪 Q Exactive Focus与 UHPLC 系统联用快速准确地分析了降解产物，见图 1、 2 和 3。
● 高分辨率准确质量数测定（HRAM）的全扫描图谱实现了快速的鉴定 – 获得降解产物元素组成的关键信息。
● 信息量丰富的高能量碰撞解离（HCD）MS/MS 图谱有利于准确鉴定降解产物。
● 全扫描和 MS/MS 模式下的正 / 负离子切换模式能全面鉴定降解产物，如图 4 和 5 所示。
● 数据分析软件 Mass Frontier 极大的提高了降解产物结构解析的速度和可靠性。
Q Exactive Focus 台式 Orbitrap MS 具有强大的功能，在一体化UHPLC/HR-MS/MS 平台上快速高效地完成降解产物分析，从而显著提高了药物研发过程中降解产物的鉴定通量。
参考文献
1. M. Brandl, Degradation Products of Mycophenolate Mofetilein Aqueous Solution Drug Development and IndustrialPharmacy, 25 (3), 361-365 (1999)
2. FDA Guidance for Industry. Analytical Procedures andMethods Validation (draft guidance), August 2000.
3. ICH guidelines Q1A (R2). Stability Testing of New Drug Substances and Products (revision 2), November 2003.
