使用Exactive Plus EMR 台式高分辨质谱分析非变性状态mAb
张晓夕1,Yue Xuan2, 李静1，顾培明1，吴泽明1，Application Group, LC-MS, CMD, Japan3
1 赛默飞世尔科技（中国）有限公司
2 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
3 Thermo Fisher Scientific, Yokohama, Japan
1 前言
在最近十年中，非变性质谱（Native mass spectrometry） 正在逐渐成为非共价结合的完整蛋白复合物表征的重要技术手段 [1]。对于完整单克隆抗体（mAbs），非变性质谱可提供分子量、糖型等的精确测量结果，还可用于高级结构（二聚、三聚和四聚）的测定；非变性质谱正在成为一种具有稳健性、快速且可靠的一线分析表征工具[2,3]。
赛默飞世尔科技在2013 年国际HUPO 大会上发布的Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 质谱仪结合了无以伦比的高分辨率精确质量Thermo ScientificTM OrbitrapTM 分析和扩展质量数范围（EMR）功能，提供了一个出色的工具，用于研究类似天然状态下保留有三级和四级结构的蛋白质和蛋白质复合物的结构学、拓扑学和构造。可用于单克隆抗体的纯度、PEG 修饰的蛋白质、低聚蛋白药物、糖型和组装蛋白质的表征。同时，Exactive Plus EMR 质谱仪的全面分析性能使之成为筛查多肽和小分子的最佳解决方案。
EMR 对Exactive Plus 系统的升级体现在：
扩展的质量数范围m/z 350-20,000；高质量数离子的传输效率更高，提升信号强度；改进的HCD 压力和控制，更容易优化实验条件；能够捕捉更短时间的时域信号，提高信噪比。
图1 配备Advion Inc. TriVersa NanoMate® 芯片电喷雾离子源的Exactive Plus EMR
2实验方法
2.1样品准备
使用单抗分子量测试标准品（Waters 186006552），按Micro Bio-Spin® Columns（BIO-RAD）标准操作步骤将单抗溶液体系置换为100mM NH4Ac，单抗样品浓度为10μM。
2.2实验条件
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基于芯片的直接注入上样条件 | |
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设备* |
TriVersa NanoMate® （Advion, USA）system |
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离子化电压（kV） |
1.9 |
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气压（psi） |
0.3-0.6 |
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*: The ESI Chip® consists of an array of 400 nanoelectrospray emitters with 5μm inner diameters. | |
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质谱条件 | |
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仪器 |
Exactive Plus EMR Orbitrap MS system（图1） |
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Mass Range |
350-20000 |
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Resolution |
8750, 17500, 35000, 70000, 140000 |
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Micro scans |
10 |
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Insource CID energy（eV） |
100-200，根据具体实验条件分别优化 |
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S-lens level（%） |
200 |
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Trapping gas pressure setting factor |
3 |
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Spectra average |
100 |
2.3数据分析
使用Protein Deconvolution 2.0SP2进行去卷积分析。
3结果讨论
对于单抗标准品分子量测试，分别采用不同分辨率（8750,17500,35000,70000,140000）测定其在非变性条件下的分子量（图2）。
Exactive Plus EMR总共具有五档不同的分辨率，供不同分析目的使用。从上图中不难看出，首先，由于在非变性状态下蛋白质样品更不易带电，与变性条件下相比，150kDa的单克隆抗体出峰在m/z 5000-8000的范围内，明显向高质量端移动。Exactive Plus EMR的m/z上限拓展至20000，可轻松胜任非变性条件下单克隆抗体乃至其多聚体的分析需求。其次，即使在最低分辨率下，仍能采集到高信噪比、基线干净的谱图，证明了Orbitrap系统所具有的高灵敏度、高质量精度和高稳定性等优点可以生成高质量、高可信度的原始数据。
从图3中可以看出，当使用最低一档分辨率（8750）时，单克隆抗体的不同糖型之间无法得到分离，通过解卷积结果也可以发现，其结果与标准分子量有较大差距。这证明当分辨率不够高时，由于测量精确度不够，造成解卷积结果与标准分子量差距较大。
图2 在不同分辨率下测定单抗分子量测试标准品分子量
图3 8750分辨率下单抗标准品分子量测定结果
图4 35000分辨率下单抗分子量测试标准品分子量测定结果
图4为35000分辨率下对单抗标准品分子量测定的原始谱图和解卷积谱图。从原始谱图中可以看出，单克隆抗体的不同糖型得到了完全基线分离，谱图干净、信噪比高。观察解卷积后的谱图可以发现，当测量精确度提高时，样品的质量精度得到了飞跃性的提高。
图5展示了在140000分辨率下对单抗标准品分子量测定的结果。从图中可以看出，当采用最高分辨率——140000进行分析时，许多在低分辨率下无法得到的峰都得到了解析。在保持高分辨率的同时，Exactive Plus EMR仍具有极高的灵敏度和质量精度，对于150kDa的完整单克隆抗体，主要糖型的质量偏差均在1.5Da之内（外标校正）。
图5 140000分辨率下单抗分子量测试标准品分子量测定结果
4小结
在本实验中，我们使用Exactive Plus EMR高分辨质谱对非变性状态下的单克隆抗体进行了分子量测定。结果表明，Orbitrap系统可以实现单抗不同糖型之间的基线分离，在保持高灵敏度、高质量精度的同时获得杂质与样品峰清晰基线分离、高信噪比的谱图。
从实验结果中还可观察到，基于Orbitrap技术的Exactive Plus EMR高分辨质谱提供了多档分辨率供选择，当分辨率过低不足以将不同修饰的质谱峰分开时，可通过提高分辨率将其分开，从而获得高精度、高可信度的结果。
基于Exactive Plus EMR的非变性质谱技术不仅可以用于单克隆抗体分子量测定，还可用于非变性状态下ADC药物的药-抗体比率（DAR）测定、抗原-抗体结合比测定及蛋白复合物分析等，具有广阔的应用前景。
参考文献
1 Heck, A. J. Nat. Methods 2008, 5, 927-933.
2 Beck, A. et al., TrAC2013, 48, 81-95.
3 Beck, A. et al., Anal. Chem. 2013, 85, 715-36.
