应用Target MS2 方法对大鼠血浆中人重组干扰素进行绝对定量的测试方案
应用Target MS2 方法对大鼠血浆中人重组干扰素进行绝对定量的测试方案
顾培明
赛默飞世尔科技（中国）有限公司
1. 前言
随着蛋白质组学的不断发展，蛋白质组学已广泛深入到生物学研究的各个领域，目前，蛋白质组学研究已经由传统的大规模鉴定逐步转向了靶向蛋白质组学，研究内容已经由蛋白质鉴定扩展到了蛋白质相对和绝对定量，对复杂样本中蛋白质的相对与绝对定量有助于发现疾病的生物标志物，对于研究各类疾病的发生与发展有着重要的意义。
基于质谱的蛋白质组学定量方法主要有SILAC，TMT，iTRAQ 以及应用三重四级杆的MRM 等，本文主要介绍了赛默飞世尔新一代台式高分辨质谱仪Q-Exactive 在目标蛋白质定量方面的应用。结果显示Q-Exactive不仅可以在ng级上样量情况下达到98% 以上的蛋白质氨基酸序列匹配度，同时应用target ms2 方法，可以很好的对复杂样本中目标蛋白质进行绝对定量，其定量下限达到了amol，动态范围达到了6 个数量级，且线性相关系数在0.99 以上。
2. 实验部分
2.1 样品信息
人重组干扰素α-2b 标准品（浓度为1mg/ml），注射人重组干扰素α-2b 后的处理组大鼠血浆样本以及空白大鼠血浆样本。
2.2 实验流程
1. 使用Full MS/ddMS2 方法对人重组干扰素α-2b 标准品酶解的肽段进行鉴定，筛选其unique peptide；
2. 将人重组干扰素α-2b 标准品酶解肽段稀释成不同浓度的标准品，其浓度分别为104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，并掺入至空白大鼠血浆样本酶解肽段中，分别上样18ul，使用Target MS2 方法根据其unique peptide 的fragment ion 峰面积，绘制标准曲线；
3. 处理组大鼠血浆酶解肽段上样18ul， 根据其unique peptide 的fragment ion 峰面积计算出大鼠血浆中人重组干扰素α-2b 的浓度。
2.3 仪器条件
2.3.1 高效液相色谱条件
高效液相色谱仪：Thermo Scientific Easy-nLC 1000
色谱柱：C18 ,3μm, 100Å ,75μm×15 cm
上样量：均18 ul
流动相：A：0.1% Formic acid in water； B：0.1% Formic acid
in Acetonitrile
色谱梯度：
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Time[mm:ss] |
Duration[mm:ss] |
Flow[nl/min] |
Mixture[%B] |
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00:00 |
00:00 |
350 |
3 |
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05:00 |
05:00 |
350 |
8 |
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42:00 |
37:00 |
350 |
20 |
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47:00 |
05:00 |
350 |
30 |
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50:00 |
03:00 |
350 |
90 |
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60:00 |
10:00 |
350 |
90 |
2.3.2 质谱条件
标准品：
质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive
喷雾电压：2.6 kV
毛细管温度：250 ℃
S-lens：50%
碰撞能量：27% HCD
分辨率设置：一级70,000@m/z 200，二级17,500@m/z 200
母离子扫描范围：m/z 200-1800；子离子扫描范围：startfrom m/z 100
Data-dependent MS/MS：Top 20
标准曲线与正式样本：
质谱仪：Thermo Scientific Q Exactive
喷雾电压：2.6 kV
毛细管温度：250 ℃
S-lens：50%
碰撞能量：27% HCD
分辨率设置：35,000@m/z 200
Isolation Window：4 M/Z
Inclusion List：M/Z 451.75
3 结果分析
3.1 筛选定量肽段
首先使用Q-Exactive 对人重组干扰素α-2b 标准品的酶解肽段进行Full MS/ddMS2 扫描，上样量为500ng（不计酶解损失），筛选人重组干扰素α-2b 的unique peptide，该肽段必须为人重组干扰素α-2b 所特有的肽段，才可以用于表征人重组干扰素α-2b 的量。
下图展示的为人重组干扰素α-2b 色谱质谱的原始图，图中可见，整个色谱峰分离比较均一，强度比较高。
将上述得到的原始文件使用Byonic 软件进行搜库处理，观察蛋白质的序列匹配度，数据库使用DrugBank 下载的人重组干扰素α-2b 的氨基酸序列。
从上述表格可见，人重组干扰素α-2b 的氨基酸序列匹配度达到了98.18%，说明Q-Exactive 的超高灵敏度，在不到500ng 的上样量的情况下可以对蛋白质进行高氨基酸序列匹配度的分析，对于后续数据分析的可靠性非常重要。
下图展示的是人重组干扰素α-2b 的具体氨基酸序列匹配情况。图中绿色标记的氨基酸序列为鉴定到的氨基酸，红色标记的为鉴定到的带有修饰的氨基酸，黑色标记的为实验中没有鉴定到的氨基酸。
从上述图中可以看出，165 个氨基酸中只有最后三个氨基酸没有被鉴定到，分析发现162 位的氨基酸为R，因而在Trypsin 的酶解中会被切割，产生的肽段为最后三个氨基酸，该肽段过短，不适于质谱检测。
从上述的色谱质谱原始图中可以看出在洗脱时间为36.28min，m/z 为451.75 的色谱峰其强度最高， 搜库
结果显示该色谱峰为人重组干扰素α-2b 的unique peptide“EDSILAVR”，下图展示的是EDSILAVR（m/z 451.75）的母离子色谱质谱抽提峰及其二级谱图，
下图为上述的肽段EDSILAVR 二级谱图的解析情况，图中可见所有的y 系列离子均被鉴定到，子离子的实测m/z 与理论m/z 偏差均在10-3 水平，谱图质量非常高，结果非常可信。另外，从二级谱图中可以看出，二级碎片子离子y4 ，m/z 458.31，其强度最高，因而在随后的数据分析中选取451.75- 458.31 这一母离子- 子离子对来表征EDSILAVR的含量，进而表征人重组干扰素α-2b 的含量（该方法即为选择反应监测技术：SRM Selected Reaction Monitoring）。
3.2 标准曲线绘制
人重组干扰素α-2b 酶解的标准肽段稀释成以下几个浓度：104ng/ml，103ng/ml，102ng/ml，101ng/ml，100ng/ml，10-2ng/ml，各自吸样8ul， 与10ul 空白血浆酶解的肽段样本混匀，上样18ul，质谱检测，检测方法使用TargetMS2，inclusion list 为m/z 451.75，isolation window 为4 m/z。对子离子458.31 进行抽提，结果见下图。
从上图可以看出，所有6 个浓度的标准品均在36min 左右有一个色谱洗脱峰出现，与上述标准品的洗脱时间一致，该色谱峰为451.75-458.31 母离子- 子离子对的色谱峰，即EDSILAVR 的洗脱峰，分别对各个色谱峰的峰面积（即上图中色谱峰上显示的MA 数值）进行积分，结果见下述表格。
从上述结果中可以看出，在6 个数量级的浓度范围内，浓度与峰面积的线性相关系数在0.99 以上，说明Q-Exactive的检测动态范围足够大，可以很好的应用于蛋白质药物代谢动力学研究。
3.3 大鼠血浆样本中人重组干扰素α-2b 浓度的测定
大鼠血浆样本上样18ul，质谱检测，原始结果见下图，图中可见在35.33min 有一个明显的色谱洗脱峰出现，洗脱时间与上述的标准品的洗脱时间相一致，为血浆样本中的人重组干扰素α-2b 的肽段EDSILAVR 的洗脱峰，对m/z 458.31 这一子离子的面积进行积分。
峰面积为9787, 代入上述的标准曲线中进行计算，得出原始血浆中人重组干扰素α-2b 浓度为26.9185 ng/ml。
4 总结
综上所述，Q-Exactive 拥有超高的灵敏度，在不到500ng 上样量的情况下对人重组干扰素α-2b 的氨基酸序列匹配度达到了98.2%；Q-Exactive 拥有足够高的动态范围，在对人重组干扰素α-2b 的标准品检测中，其动态范围达到了6个数量级，并且线性相关系数达到了0.99 以上。简而言之，Q-Exactive 的超高性能可以很好的应用于大分子药物代谢的研究中去。
