非损伤性扫描离子选择电极技术及其在高等植物研究中的应用

印莉萍¹    上官宇²    许越^{2 *}

 

1.    首都师范大学生命科学学院， 北京 100037; 2.Younger USA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA;)

 

摘要  各种分子和离子进出细胞的过程对于维持植物体自身的活性至关重要.非损伤性扫描离子选择电极技术(Scanning Ion-selective Electrode Technique,SIET)在不接触被测生物样品－即在保持被测生物样品完整和近乎实际生理环境的状态下，获得进出样品的各种分子和离子的信息.该技术不仅能够测量离子及分子静止状态下的绝对浓度，而且还可以测量它们进出生物样品的运动速率及运动方向.SIET可以围绕被测的单个或多个细胞、组织甚至器官进行灵活、方便而准确的立体测量并获得被测物体周围的离子或分子的三维立体数据.目前，SIET不但可以分别测量H⁺,Ca²⁺,K⁺,Al³⁺,Cd²⁺,Cl^-和O₂，CO₂，NO及温度等参数，而且可以同时采集多种离子及参数，为获得生物样品内外分子或离子运动的有关信息提供了良好的实验平台.

关键词 非损伤性电生理技术 离子选择性电极 离子跨膜转运 SIET

 对于跨膜的离子分子活性和转运机制的研究始终是植物分子生理学研究的一个重要方面.特别是在基因组研究后期所面临的一个挑战就是如何理解和确认那些未知的或者人工表达的蛋白质功能，特别是细胞质膜上的离子的转运载体，以及由这些蛋白质所产生的众多信息是如何被细胞正确地整合到一起的.非损伤性扫描离子选择电极技术(Scanning IonSelective Electrode Technique, SIET)作为一个综合性较强的电生理技术成为迎接这一挑战的理想工具.

SIET 技术的核心是离子和分子选择性微电极(以下简称：离子电极)(图1)，由Kühtreiber和 Jaffe^[1]设计的一套由计算机控制的自动定位测量系统演变发展而成.在计算机控制、信号放大和三维测量方面做了较大的改进^[2].由于SIET能够以非损伤的方式测量到进出生物材料的离子以及分子的运动速率，并随着离子/分子电极种类的不断增多以及电子线路技术和计算机硬件软件的逐步完善，SIET逐渐被应用到基础生物学、生理学、神经生物学、空间生物学、临床医学、基础医学、病理学、毒理学、营养分子生理学、农林学及药物机理研究等领域^[3，4].

尽管人们通过膜电压的测量，如膜片钳技术^[5，6]，及与显微技术相结合的荧光染料技术，获得了一些有关离子分布和运动的情况，但是，SIET技术作为对上述几项技术的重要补充，并以其特有的时间和空间分辨率，为鉴定或验证某些生物膜转运系统的功能提供了非常有力的工具.在这篇综述里，我们将介绍SIET的基本原理、方法及其在高等植物细胞研究中的应用.

图1 离子选择性电极和SIET的时间和空间分辨率分布

(a)Ca²⁺微电极的显微照片，由液体离子交换剂(LIX)和电解质组成；(b)图中A表示通过染料标记或膜片钳等局部研究方法的时空分辨率；B表示整体组织研究过程中通过较慢的化学痕量方法的时空分辨率；而SIET作为一个开放式的实验平台，较好地填补了较慢的化学痕量方法与较快的染料标记或膜片钳等方法两者之间的技术空白.

　

1 SIET 原理

1.1物理学及数学基础

物质在液体环境中有从高浓度到低浓度扩散的趋势.对于带电粒子而言，还有从高电化学电势到低的电化学电势运动的趋势.如果，离子电极的移动距离dx在几十微米以下，生物材料实验证明，影响带电粒子运动的电化学电势的梯度可以忽略不计，那么，该离子的扩散运动速率可以通过Fick
第一扩散定律计算出来^[7] (图2).

图2以Ca²⁺浓度梯度和Ca²⁺微电极为例说明SIET的物理学及数学原理

 

离子选择性电极由玻璃微电极、Ag/AgCl导线、电解质(100mmol/L CaCl₂)及液态离子交换剂(LIX) 4部分组成.该电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量，并分别获得电压V₁V₂.两点间的浓度差dc则可以从V₁，V₂及已知的该电极的电压/浓度校正曲线计算获得.D是离子/分子特异的扩散常数(单位:cm^-2sec^-1)，将它们代入Fick的第一扩散定律公式： J_o= - D * dc/dx ，可获得该离子的移动速率(单位：pmol cm^-2sec^-1)，即：每一秒钟通过一个平方厘米的该离子/分子摩尔数 .

液态离子交换剂是基于大型中性分子载体的一类有机化合物.目前可以购买得到一些常见的LIX.有些研究人员根据自己的需要还自行开发特殊的LIX，其他的种类还在不断的开发中. 

1.2计算机技术及系统集成

SIET的诞生、发展与完善与计算机技术的不断进步是密不可分的^[2,8] .尽管计算机需要同时控制三维运动系统、显微成像系统和信号放大系统3个子系统，但由于离子选择电极相对较低的时间分辨率要求，使得普通的个人计算机也可以完全胜任.这为SIET的普及和发展提供了很好的基础. 

1.3 SIET的缓冲溶液

在使用SIET技术过程中，通常要在溶液中加入一些缓冲剂成份，如：MES，Tris或EDTA 等，用以稳定被测离子以便离子选择电极进行测量^[9-12] .然而，如果离子缓冲剂选择或者使用不当，被测离子会与缓冲剂相互干扰，破坏被测离子的浓度梯度或者被大幅度压缩，从而严重影响到SIET的应用效果.Kunkel 等通过系统的比较试验，寻找到了一些最适合SIET
技术的溶液pH 缓冲剂及其使用方法，并以实际生物材料的研究证明通过使用这些方法可以将SIET测知离子流动速率的能力达到最大化^[13].因此，在SIET
实验设计过程中，不但要考虑到测量溶液中各种成份对被测样品生物活性的影响，还要充分考虑到缓冲剂成份对被测离子梯度的作用以及对液态离子交换剂（LIX）有无严重干扰.

1.4 SIET测量的空间几何构型

现有的1-2m微米直径的离子电极，在电极距被测材料2-20
μm及dx在5-30μm的技术条件下，被测材料离子流动的空间几何分布可以大致分为3类：点、平面及球体.在离子电极距被测材料小于5μm时，通常认为离子以平面方式运动.

值得一提的是，SIET是目前世界上惟一能够按照研究人员的设定，以手动或编程的方式，从任意角度(相对于被测物体表面)用离子选择电极对被测样品进行测量的系统.利用SIET灵活的空间测量方式的经典的例子是对植物花粉管生长过程中，尖端Ca²⁺内流的研究^[13]. Kunkel 等发现花粉管的生长与Ca²⁺内流密切相关，只有在花粉管尖端迅速生长的部位才能检测到Ca²⁺内流速度.已经伸长成熟的花粉管，几乎检测不到Ca²⁺内流速率.人们不但能够测量出Ca²⁺的内流速率，而且还计算出该花粉管尖端一个圆盘式的结构是Ca²⁺进入细胞的区域(Cardenas等 1999).

2 SIET 的应用

SIET诞生和发展是在植物学研究中实现的.这可能与植物细胞外的细胞壁对膜片钳技术来讲操作较为困难有关.而利用SIET特有的非损伤性特点，可以在不对细胞、组织甚至器官造成任何损伤的情况下测知离子分子的转运情况.正是意识到SIET的这一优势， Kochian 等在原有的Ca²⁺选择微电极的基础上，又相继开发出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺离子选择性电极，将其应用于玉米根和植物毒理学的研究，并为这些电极在动物研究中的应用开辟了道路^[15-17].随后，SIET技术被应用于整体根、根毛及花粉管的研究，并阐明了诸如钙离子转运与样品内部活动及生长的相关性^[14，18-24].Messerli等应用SIET技术将脉动式的花粉管生长所体现的周期与离子流动速率表现出的频率相互联系起来. ^[25]

2.1离子与分子流动的同时测量证明了花粉管碱化带的存在

Hepler等发现不断生长的百合花粉管前端存在有一个碱化带，之后他们提出该碱化带可能是由于区域的线粒体的密集存在所致^[23].许越等应用SIET特有的双电极同时测量功能，发现H⁺离子的外流和O₂分子的内流是引起该碱化区的主要原因.花粉管的生长需要大量的能量，能量来源于线粒体的氧化磷酸化. O₂分子的内流，伴随H⁺离子的外流是形成能量的主要驱动力.也正是由于H⁺离子的外流造成了花粉管前端局部的碱化带，从而证明Hepler等的假说是正确的(图3)

图3
H⁺和O₂ 流动速率的同时测量.

(a)显微照片显示金属氧电极与玻璃H⁺电极同时测量百合花粉管生长过程中H⁺离子和O₂分子进出的变化；(b)在花粉管线粒体密集区域,
或称固有碱化带区域，同时存在的H⁺外流和O₂内流现象.

 

 

2.2 SIET与荧光显微技术结合证明磷脂酰肌醇转运蛋白与根毛发生有关

Vincent 等在鉴定出拟南芥磷脂酰肌醇转运蛋白家族 (PITPs)的一种成份AtSfh1p 之后，将显微荧光技术与SIET
结合，从细胞的内部和外部同时证明AtSfh1p 在根毛顶端生长过程中，具有调节细胞内质膜磷酸肌醇极性运输、Ca²⁺信号传递和细胞骨架的功能.在植物细胞的极性生长机理研究方面向前推进了一步.

拟南芥缺失根毛突变体（AtSfh1p）不仅在根毛形态上有变化，不规则弯曲，失去重力极性；而且在Ca²⁺信号传递方面也有异常^[26].
利用Ca²⁺荧光显微技术可测定细胞内部Ca²⁺浓度梯度，而利用SIET可测得外部Ca²⁺流动情况.结果表明野生型的根毛只有在生长旺盛的顶尖区，Ca²⁺的内流速度快，而突变株的根毛Ca²⁺流动的方向和大小明显不同于野生型的根毛.非重力方向的根毛，四周表面都可以检测到Ca²⁺的内流，而且流速高于野生型的两倍左右. ^[26]

 2.3 多离子电极的同时应用证明Ca²⁺及H⁺在植物感知重力变化中起作用

美国北卡罗来纳州立大学植物系NSCORT
研究组受美国宇航局资助，研究植物感知重力的遗传及生理机理，通过对重力非敏感的拟南芥突变体的研究，许越等发现植物根部在相对于地球重力不同的位置的情况下，其H⁺和Ca²⁺的流动在根部的不同位置呈现出不同的变化，显示出及H⁺和Ca²⁺可能在植物感知重力变化的过程中扮演一定的角色(图4)
^[6].

图4
利用SIET 对重力非敏感植物突变体Ca²⁺及H⁺变化的同时测量.

(a)拟南芥突变体（ARG）及其野生型拟南芥（WS)；(b)ARG在重力变化刺激下的 Ca²⁺及H⁺变化与野生型对照有明显的区别.

 

3 总结及展望

经过多年的改进，SIET数据的生成、采集以及校准等方面不断得到完善.特别是应用SIET
强大的三维立体测量方式，研究人员可以获得其他电生理技术无法测到的被测样品某些点的特异活性^[8，27-29]. SIET 是一个与膜片钳^[30]无论在时间分辨率还是在空间分辨率上都不相同的技术，但两者在应用过程中可以极好地相互补充.由于SIET
技术的出现，人们对于生物体特异离子转运系统的研究，在灵敏度上，时间和空间分辨率上已经被大大地提高了，并已成熟地与细胞和分子生物学技术、其他电生理技术和显微荧光成像技术配合使用.SIET
技术将在主动运输离子或分子泵和协同运输载体的研究方面发挥重大的作用.

分子生物学的进展使得我们能够对质膜转运载体分子加以确定、克隆和进行可控制的表达.当这些转运载体在分子水平方面通过在酵母、卵细胞等系统中的表达予以鉴定，或者某些细胞成份的物理结构和生理功能阐明之后，SIET
技术的非损伤性，多离子/分子同时测量及灵活的空间测量方式将在细胞和组织水平上的功能鉴定方面发挥重要的、甚至是无法替代的作用.

　

致谢

感谢匡廷云院士在身患重病的情况下对SIET
技术的关心与支持.同时感谢美国Duke大学裴真明教授所作的有益的讨论. 

 

参考文献

1.       
Kuhtreiber W M and Jaffe L F. Detection of extracellular calcium gradients with a calciumspecific vibrating electrode. J. Cell Biol,1990, 110(5): 1565-1573

2.       
Shipley A M and Feijo J A. The use of the vibrating probe technique to study steady extracellular currents during pollen germination and tube growth. In Fertilization in Higher Plants -Molecular and Cytological Aspects, Springer-Verlag. 1999, 17: 235-252.

3.       
Porterfield D M, Laskin J D, Jung S-K, et al. Proteins and lipids define the diffusional field of nitric oxide. Measurement of nitric oxide fluxes from macrophages using a self-referencing electrode. Am. J. Physiol. Cell Physiol, 2001, 281(4): L904-912

4.       
Smith P J S and Trimarchi J R. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol, 2001,280: C1-C11.10

5.       
Cao Z-S，Kang H-G. Zou S-B, et al. Application of Patch-clamp Technique into the Study of Cell Secretion. Progress in Biochemistry and Biophysics， 1992，19(1): 14-18

6.       
Xu Y. Introduction of the SIET. Raleigh, NC, YoungerUSA, Company. http://youngerusa. com/NY/Chinese/basics/04sanya _talk.php. [2004-06-06]

7.       
Schiefelbein J W , Shipley A M, Rowse P, et al. Calcium influx at the tip of growing root-hair cells of Arabidopsis thaliana. Planta, 1992, 187: 455-459.

8.       
Richardson D C and Richardson J S. Teaching Molecular 3-D Literacy. Biochemistry and Molecular Biology Education，2002，30: 21-26.

9.       
Pfanz H and Heber U. Buffer capacities of leaves, leaf cells, and leaf cell organelles in relation to fluxes of potentially acidic gases. Plant Physiology, 1986,81: 597-602

10.   
Pierson E S, Miller D D, Callaham D A, et al. Pollen-Tube Growth Is Coupled to the Extracellular Calcium-Ion Flux and the Intracellular Calcium Gradient - Effect of Bapta- Type Buffers and Hypertonic Media. Plant Cell, 1994,6(12): 1815-1828

11.   
Arif I, Newman I A, and Keenlyside N. Proton flux measurements from tissues in buffered solution. Plant, Cell and Environment，1995，18: 1319-1324

12.   
Demarest J R and Morgan J L M. Effect of pH buffers on proton secretion from gastric oxyntic cells measured with vibrating ion-selective microelectrodes. Biological Bulletin， 1995，189: 219-220

13.   
Kunkel J G, Lin L-Y, Heper P K,et al. The strategic use of Good buffers to measure proton gradients about growing pollen tubes. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Amherst, IOS Press, 2001: 81-94

14.   
Cardenas L, Feijo J A, Kunkel J G , et al. Rhizobium Nod factors induce increases in intracellular free calcium and extracellular calcium influxes in bean root hairs. Plant J ，1999，19(3): 347-352

15.   
Huang J W W, Shaff J E, Grunes D L,et al.Aluminum Effects On Calcium Fluxes At the Root Apex of Aluminum-Tolerant and Aluminum-Sensitive Wheat Cultivars. Plant Physiology,1992, 98(1): 230-237

16.   
Kochian L V, Shaff J E, Kuhtreiber W M，et al. Use of an Extracellular, Ion-Selective, Vibrating Microelectrode System For the Quantification of K+, H+, and Ca2+ Fluxes in Maize Roots and Maize Suspension Cells. Planta, 1992,188(4): 601-610

17.   
Degenhardt J, Larsen P B, Howell S H,
et al. Aluminum resistance in the Arabidopsis mutant alr-104 is caused by an aluminum-induced increase in rhizosphere pH. Plant Physiology ，1998，117(1): 19-27

18.   
Miller D D, Callaha m D A, Grass D J，et al. Free Ca2+ Gradient in Growing Pollen Tubes of Lilium.Journal of Cell Science, 1992,101: 7-12

19.   
Felle H H and Hepler P K. The cytosolic Ca²⁺ concentration gradient of Sinapis alba root hairs as revealed by Ca2+-selective microelectrode tests and fura-dextran ratio imaging. Plant Physiology, 1997,114(1): 39-45

20.   
Holdaway-Clarke T, Feijo J A, Hackett G A, et al. Pollen tube growth and the intracellular cytosolic calcium gradient oscillate in phase while extracellular calcium influx is delayed. Plant Cell, 1997,9 (11):1999-2010.

21.   
Holdaway-Clarke T, Hackett G A, Feijo J A，et al. Oscillations of cell expansion rate, cytoplasmic calcium, and calcium influx in the pollen tube. J of General Physiology, 1998,112(1): 35A-35A

22.   
Shabala S N, Newman I A, and Morris J. Oscillations in H+ and Ca²⁺
ion fluxes around the elongation region of corn roots and effects of external pH. Plant Physiology, 1997,113(1): 111-118

23.   
Feijo J A, Sainhas J, Hackett G R,
et al. Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip. Journal of Cell Biology，1999，144(3): 483-496

24.   
Newman I A. Ion transport in roots: measurement of fluxes using ion-selective microelectrodes to characterize transporter function. Plant Cell Environ, 2001,24(1): 1-14

25.   
Messerli M A and Robinson K R. Cytoplasmic acidification and current influx follow growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes. Plant J, 1998,16(1): 87-91

26.   
Vincent P, Chua M, Xu Y, et al. A Sec14p-nodulin domain phosphatidylinositol transfer protein polarizes membrane growth of Arabidopsis thaliana root hairs. J. Cell Biol. 2005,168(5): 801-812.

27.   
Xu Y. How does the SIET works? Raleigh, NC, YoungerUSA, Company. http://www.youngerusa.com/movies/SIET.  [2004-06-06]

28.   
Pei Z M, Murata Y, Benning G, et al. Calcium channels activated by hydrogen peroxide mediate abscisic acid signalling in guard cells. Nature, 2000, 406(6797): 731-734

29.   
He Y, Tang R-H, Hao Y,
et al. Nitric Oxide Represses the Arabidopsis Floral Transition. Science,2004, 305(5692): 1968-1971

30.    
Xu, Y. and Qiu Z. Patch-Clamp Technique and Its Applications to and Prospects for the Studies of Higher Plant Cells. Plant Physiology Communications, 1993, 29(3): 169-174.

旭月（北京）科技有限公司 供稿
网址:http://www.xuyue.net
电话:010-82622628、82622629
邮箱:pub@xu-yue.com