外周血由于采集难度小，一直是疾病标志物研究和临床诊断应用的主要载体。外周血蛋白标志物的检测更是能够监控疾病的动态变化，成为主要的标志物类型。尤其是对于非肿瘤疾病，在没有CTC细胞和ctDNA作为协同标志物的前提下，外周血中蛋白标志物的筛选与检测就显得尤为重要。
然而，外周血中的蛋白质高度复杂，动态范围达11-12个数量级，既有以白蛋白（Albumin）为代表的mg级的高丰度蛋白质（占据外周血总蛋白质量的99%），又有以细胞因子为代表的fg级蛋白质。因此，对于外周血蛋白标志物的筛选和研究也充满着挑战。
一般情况下，对于复杂的蛋白质的筛选来说，液相色谱-质谱串联（LC-MS/MS）技术成为首选。然而，常规LC-MS/MS技术基于bottom-up的筛选策略（将所有蛋白质无差别的酶解成多肽后，同步进入质谱进行检测），在大量高丰度蛋白存在的情况下，LC-MS/MS往往会更倾向于检出高丰度蛋白质，对于ng级以下的低丰度蛋白质（尤其是IL-1β、IL-6、INF-γ等重要细胞因子）的检测能力严重不足。
同时，外周血中的蛋白质来源丰富，既有细胞凋亡脱落的表面蛋白，也有细胞主动分泌的细胞因子，还有多种细胞分泌的外泌体所携带的蛋白质等。经过大量实验数据累积，我们发现在外周血蛋白质组研究如果仅用传统的LC-MS/MS实验方案进行筛选，数据始终是片面的。同样的血浆样品，用LC-MS/MS和Antibody Array技术所筛选到的蛋白种类和功能类别交叉性很少，而外泌体携带的蛋白质既与血浆total蛋白组检出数据有一定的交集。同时，对于特定类型的蛋白质，外泌体也具有显著的富集效果（如下图）：
| 华盈生物外周血蛋白质组学分析
为获得高质量的外周血蛋白质组数据，华盈生物在检测方法上进行了创新升级，以尽可能观测到外周血蛋白质组的全谱，形成了独特的外泌体蛋白组“1+1+1”体系。
● 首先，利用FAIMS和TIMS为代表的4D质谱预处理装置，对进入MS前的离子进行预筛选，简称“离子过滤”。通过电场和氮气源的综合作用，将特定离子尤其是1价杂离子进行有效去除，提高进入质谱仪的离子纯度，进而在传统LC-MS/MS鉴定深度的基础上再提高10%-20%的鉴定蛋白谱。
● 进一步，华盈生物利用特色的抗体芯片技术对于LC-MS/MS所不能识别的分泌蛋白类型进行补充鉴定，一次性可特异性的检测500+种蛋白质，极大地丰富了外周血低丰度蛋白谱。
● 同时，华盈生物利用在外泌体定量蛋白质组学上的优势，在获得高纯度外泌体的基础上，利用LC-MS/MS技术进行深度的外泌体蛋白质组解析，将对于外周血中的蛋白谱，尤其是外泌体携带的母本细胞的膜蛋白谱进行更加全面的覆盖。
| 经典案例
国家蛋白质组中心研究团队发现银屑病治疗中成药“银屑灵”在临床上对不同患者疗效存在差异性，为在治疗前帮助临床医生找到“银屑灵”的适应患者，研究人员利用深度蛋白质组学技术（LC-MS/MS 结合 Antibody Array）的策略开展用药伴随标志物研究。
研究结果显示：利用LC-MS/MS的DIA技术筛选到的蛋白质与Antibody Array筛选到的蛋白质的种类具有明显的分界线，即LC-MS/MS筛选到的蛋白谱主要集中在血清中ng级以上的蛋白质群体，而Antibody Array筛选到的蛋白谱主要集中在ng-pg级的蛋白质群体中。同时，两种技术均发现了一些“银屑灵”差异响应（Responder vs Non-responder）蛋白质，组合两种技术筛选到的蛋白标志物可以更为有效地对“银屑灵”差异响应患者进行区分。
| 相关文献
[1]. Xihao Du, Qingli Zhang, Yixuan Jiang，et al. Dynamic molecular choreography induced by traffic exposure: A randomized, crossover trial using multi-omics profiling. J Hazard Mater. 2022 Feb 15;424(Pt A):127359.
[2]. Meng Xu, Jingwen Deng, Kaikun Xu, et al. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine. Theranostics, 2019, 9(9):2475-2488.
