ChIP染色质免疫沉淀技术服务-chip实验原理及流程

ChIP（chromatin immunoprecipitation assay, 染色质免疫共沉淀）是研究体内DNA与蛋白结合的重要技术，主要包括ChIP-qPCR和ChIP-seq两种；其中ChIP-qPCR用来验证与目标蛋白结合的已知DNA片段，ChIP-seq用来筛选与目标蛋白结合的未知DNA片段。

先用甲醛交联细胞内“蛋白-DNA”复合物，并用超声波破碎DNA至适合的长度。细胞裂解后，孵育结合了抗体的珠子，诱饵蛋白通过其抗体便结合到了Beads上，同时和诱饵蛋白互作的DNA，也一起沉淀到Beads上。洗涤掉未结合的DNA后，再用洗脱液将DNA-蛋白复合物从Beads洗脱下来，便得到染色质免疫共沉淀产物。DNA-蛋白复合物去交联后，既可qPCR检测已知DNA片段，也可用二代测序与蛋白互作的DNA片段。

当没有合适的诱饵蛋白抗体时，可以通过表达融合了flag标签的诱饵蛋白，利用flag标签做免疫沉淀。即细胞过表达Flag-Bait，经裂解后与anti-Flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与Beads结合，与诱饵融合蛋白互作的DNA“共沉淀”到Beads上，再经洗涤、洗脱后做qPCR或NGS测序。

染色质免疫沉淀ChIP实验流程-辉骏生物

带标签的染色质免疫共沉淀流程图：

应用领域

ChIP技术应用背景

◆ 基因表达是一个复杂、调控有序的过程，DNA与蛋白质的相互作用是基因转录起始和调控的关键，研究它们的相互作用是研究染色质上基因表达调控的重要领域。

◆ chip（染色质免疫共沉淀）是检测体内条件下DNA与蛋白质相互作用的方法，该技术由 Orlando等于1997年创立，目前已广泛应用于组蛋白修饰、转录因子作用位点和DNA甲基化等研究中。

◆ 转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用来激活或抑制基因表达的DNA结合蛋白。转录因子有4个主要结构域：DNA结合域决定了转录因子的特异性，转录调控域（包括激活域或抑制域）决定了转录因子的功能，寡聚化位点使不同转录因子间发生相互作用，核定位信号控制转录因子进入细胞核。

◆ 组蛋白是染色质基本结构——核小体中的重要组成部分，其N-端尾部暴露在核小体的表面，可发生乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、多聚 ADP 糖基化等共价修饰，影响组蛋白与DNA的亲和性，改变染色质的疏松或凝集状态，或影响其它转录因子与靶基因启动子的亲和性，激活或抑制基因表达。

◆ DNA甲基化是在不改变DNA序列的前提下，由DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的甲基转移到DNA上，其中发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化（5-mC）是DNA甲基化的主要形式。甲基的引入使DNA分子空间结构改变，DNA大沟无法与DNA结合蛋白（转录因子、拓扑异构酶、RNA聚合酶、阻抑蛋白等）正常结合，导致某些基因转录失活。因此，DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

研究者首先发现Ncor1(编码NCoR)和Ncor2(编码SMRT)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、胚胎干细胞(ESC)和OSKM重编程细胞中均有表达。无论用怎样的转导方法、报告系统、MEF类型或培养基，抑制Ncor1/2的表达都能增强OSKM诱导的重编程。

本研究发现NCoR/SMRT–HDAC3共抑制复合物通过与OSKM因子（尤其是c-MYC）相互作用为重编程制造障碍，这一发现揭示了c-MYC在重编程中的双重作用，也有助于解释为何用OSKM而非OSK诱导重编程更容易产生pre-iPSCs，以及为何用HDAC抑制剂对OSKM而非OSK诱导的重编程能产生更强的效果等问题。

Zhuang Q. et al: NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming. Nature Cell Biology. 2018. (IF=28.824)

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