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技术路线 UPLC------Q-TOF LC/MS
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| 服务商： 西农生(北京)生物技术有限公司 | 查看该公司所有服务 >> |
中药入血入靶成分分析
本公司建有成熟的代谢组学检测平台，通过UPLC-MS超高效液相串联高分辨率质谱检测，结合本地自建中药数据库、以及HMDB、Lipidmaps、METLIN、OTCML等代谢组学权威代谢数据库，使用MExplorer、QI、Unifi等业内权威软件，在以下三个方面对中药领域展开代谢组学检测研究：
（1）对中药材中的各种化合物成分进行准确的定性和定量分析，为中药材的甄别鉴定、质量评估和炮制工艺优化提供重要依据。
（2）针对中药入血入靶后不同时间点，检测药物成分在体内代谢情况的变化。
（3）对中药干预动物后的内源性代谢物的改变、代谢途径和作用机制进行系统性研究。
实验操作步骤如下：
中药样本前处理：
- 将样品解冻，取200mg中药冻干粉，加入2mL70%乙醇水溶液，涡旋1min；
- 冰水浴超声提取60 min;
- 离心10 min（13000 rpm，4℃），取上清液；
- 上清液用0.22μM过滤器过滤;
- 取200 μL装入带内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析。
血清样本前处理：
- 将-80℃下保存的样本取出,在冰上缓慢解冻,移取样本100 μL至1.5 mL EP管中;
- 加入300 μL蛋白沉淀剂甲醇/乙腈(V:V=2:1),涡旋震荡1 min;
- 冰水浴超声提取10 min,-20℃下静置30 min;
- 离心10 min(13000 rpm,4℃);
- 取上清液,真空离心浓缩1.5h;
- 用200 μL 50%甲醇水溶液复溶,涡旋1 min,超声3 min;
- 离心10 min(13000 rpm,4℃),取150μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析。
质控样品由所有样本的提取液等体积混合制备而成,每个QC的体积与样本相同。
本实验分析仪器为Ultimate 3000超高效液相串联Q-Exactive高分辨质谱仪。
色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm, 1.8 um）；
柱温：50℃ ；
流动相：A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）；
流速：0.3mL/min；
进样体积：5 μL。
质谱条件（样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式）：
离子源：HESI；
数据采集模式：DDA；
扫描方式：Full MS/dd-MS2。
TIC（Total Ion Chromatogram）全称为总离子流色谱图。它表示在质谱分析的全过程中，每个时间点（或每个扫描点）所检测到的所有离子强度的总和随时间变化的曲线。
BPC（Base Peak Chromatogram），全称为基峰色谱图。它表示在质谱分析的全过程中，每个时间点（或每个扫描点）所检测到的所有离子中强度最大的那个离子（即基峰）的强度随时间变化的曲线。
采用Progenesis QI 3.1软件处理采集的质谱数据，步骤依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取和去卷积。本次分析使用的数据库为结合TCMSP、TCMBank、PubChem等数据库建立的包含该中药复方中已知的活性成分的数据库，通过母离子质量偏差、二级碎片、同位素分布、峰强度及人工核验等方法对鉴定结果进行多维核验和综合判断，得到最终结果。
QI搜库结果的定性分析：
对于中药复方，首先保证中药复方组有较好的峰响应，通过筛选综合得分大于等于36分（满分为60分时）、碎片得分大于零（保证至少有一个碎片是与数据库中碎片匹配上的）和质量偏差在±10ppm之间的物质作为原方成分。
对于原方成分入血分析，首先保证给药组有相应的峰响应，然后筛选给药组与空白组的FC值≧5的物质作为入血成分。
将鉴定到的中药原方成分中信号强度排名前25的活性物质根据保留时间在TIC图上标注。
图 5.活性物质归属图
将鉴定到的中药原方成分中信号强度排名前10的活性物质，基于数据矩阵中数据进行比例图示：
图 6.成分含量TOP10分布图
将鉴定到的中药活性成分进行中药归属，基于数据矩阵中数据进行比例图示：
图 7.成分归属数量分布图
