免疫共沉淀(Co-IP)实验技术服务

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）

一、实验原理
以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基础的用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。


CO-IP应用与IP区别
1、测定两种目标蛋白质是否在体内结合
2、确定一种特定蛋白质的新的作用搭档
CO-IP与IP只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）

二、实验过程
1、提取蛋白。
2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体。
3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上)。
若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物：“Y—X—抗X抗体—Protein A或G"
4、经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。（xy抗原、x抗体）。
5、western blot分析，质谱分析。

（Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的Fc区结合。）

ProteinA/G的作用及原理
“捕获”抗体，形成复合物，
抗体-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共价健结合
ProteinA/G- beads 共价结合

三、CO-IP特征
优点：
1、相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态。
2、蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
3、可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

局限性：
1、可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用
2、两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用；
3、必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果


四、实验的关键
1、实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。
2、为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。
3、考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。
4、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

五、注意的问题：
1、裂解液
(1)、细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。
(2)、不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktail

2、免疫沉淀中抗体的选择

3、抗体
使用对照抗体：（阴性和阳性）
阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG
兔多克隆抗体：正常兔IgG
阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A，用膜蛋白B）

六、未检测到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
1、样品被蛋白酶降解：
添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融

2、抗体浓度太低：
调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度

3、抗抗体亲合力太低：
选用适合于IP和/或IB的相应抗体

4、IP抗体未与珠子结合：
选用适合于IP的相应珠子，正确保存防止变质或干燥

5、Tag未暴露在融合蛋白构象的表面：
改变tag融合表达部位

6、裂解液严谨度太高：
改用低严谨度裂解液

七、目得蛋白高背景
可能原因
1、非特异蛋白结合：
（1）在无血清培养液中裂解细胞；
（2）在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子预洗，
（3）免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）

2、裂解液严谨度太低：
改用高严谨度裂解液。

3、实验仪器或液体被污染：
使用洁净的仪器或液体。
4、转移膜上的非特异吸附：
戴手套，用镊子夹取，不要接触膜转移面。

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