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代做ChIP实验

代做ChIP实验


chromatin immunoprecipitation assay, ChIP
染色质免疫沉淀技术(ChIP)的基本原理是把活细胞内的蛋白质和DNA交联,将其随机切断为一定长度的染色质小片段,然后用目的蛋白抗体免疫沉淀蛋白-DNA复合体,从而特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
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最后更新:2016-6-24半年访问:98
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ChIP实验流程如下图所示,具体操作步骤包括:
 

第一步、细胞的甲醛固定 

交联所用的甲醛终浓度约为1%,而交联时间需要预实验来确定。交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。通常的交联条件为室温10 min。 

第二步、超声波断裂染色质 

甲醛交联后的染色质对限制酶和DNase I高度抵抗,因此通常使用超声使得染色质断裂。超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,这都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时,要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证低温。总超声时间也不要太长,以免蛋白降解。打断后的染色质片段的长度主要集中在200-1000bp左右(可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定)。

 

第三步、用特异性抗体与目的蛋白结合,免疫沉淀蛋白和DNA复合物。 

抗体的量要进行优化,防止非特异的结合。用Protein-A/G Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质。 

第四步、65℃解交联蛋白质和DNA复合物,消化蛋白质,纯化富集的DNA。 

在免疫沉淀复合体中加人不含DNase的RNase和蛋白酶K,65℃保温6h以上,使交联逆转。交联逆转后用QIAquick DNA cleanup system纯化回收DNA。纯化的DNA极少,可用NanoDrop? ND-1000仪定量。

 
ChIP质量控制的技术指标
 
抗体与目的蛋白结合的有效性和特异性。ChIP所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的,只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验的检测。 

交联的条件:交联所用的甲醛终浓度约为1%,而交联时间需要预实验来确定。通常的交联条件为室温10 min。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。 

超声片段的大小:打断后的染色质片段的长度应主要集中在200-1000bp左右。交联时间如果过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果,而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短,则交联不完全,产生假阴性。 

阳性与阴性对照:在做ChIP实验时,一定要做好实验对照,因为没有对照,很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照,阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等;阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能,所以通常还会选择数对阴性引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。
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