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代做免疫印迹Western Blot实验
代做免疫印迹Western Blot实验,代做WB实验,免疫印迹实验外包服务,WB实验外包服务
服务类别:免疫与抗体总访问:4696
最后更新:2013-4-7半年访问:66
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代做免疫印迹Western Blot实验,代做WB实验
Western Blot标准protocol
 
WB检测基本过程
1、获取细胞或组织裂解物
1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:

蛋白位置
推荐buffer
全细胞
NP-40 or RIPA
胞浆(可溶性蛋白)
Tris-HCl
胞浆(骨架结合蛋白)
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量
2)选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!
2、蛋白定量
常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白
3、电泳分离蛋白质
根据待测蛋白状态确定电泳条件:
根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量(kDa)
凝胶浓度(%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8

4、转膜
根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率最高。
 
5、封闭
去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
 
6、一抗孵育
一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:
  • 选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)
  • 选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)
  • 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体  
 7、二抗孵育
根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时
8、底物孵育
选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量
9、结果分析和检测
凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
Note:从封闭开始,每步之间都需要用TBST进行洗涤,3次,每次5min
 
 

 

上海维景生物科技有限公司是一家专注生命科学领域的企业,借助中科院细胞与免疫学实验平台,拥有强大的资金背景支持和专业的团队等资源。公司面向全国市场,迅速发展,广纳英才,现已建成专业生命科学产品销售团队,其中大部份是在生命科学市场上工作多年,有丰富的销售经验,也有良好的客户资源,销售渠道全面覆盖华东大部分工业以及科研客户,团队中免疫学及相关专业硕士以上学历人士达50%,有较强的技术支持能力,在针对专业技术服务中能够提供完善周到的专业化服务,对客户在使用产品过程中提出的问题能满意答复,并可及时传递最新的产品技术资料信息。  
 
上海维景生物科技有限公司凭借优质的技术服务平台和专业的技术服务团队,维景生物倾情打造最高质量的技术服务。至今,已为广大科研客户和合作伙伴提供了实时定量 PCR、细胞凋亡、 Western-blot 、 Elisa 、免疫组化、原位杂交、质粒载体的构建、稳定细胞系的筛选、 siRNA干扰效率的鉴定、双萤光报告系统、蛋白表达及纯化、腺病毒 / 腺相关病毒 / 慢病毒的包装服务、单多克隆抗体的制备、 SCI文章的修改及发表服务等。
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