Raltitrexed精准抑制胸苷酸合成酶，揭示DNA复制与肿瘤治疗新机理

▲ Raltitrexed (T6632)，CAS: 112887-68-0

Raltitrexed (T6632)，CAS: 112887-68-0 是一类核苷抗代谢物/类似物，直接抑制胸苷酸合成酶（TS），该酶将 dUMP 还原甲基化为 dTMP，是从头合成胸苷酸的限速步骤。Raltitrexed 占据 TS 的叶酸结合位点并与酶‑dUMP 形成稳定复合物，阻断 5,10‑亚甲基四氢叶酸提供一碳基团，从而使 dTMP/dTTP 储量下降，削弱 DNA 合成与修复 [1,2]。其生化效力高（IC50 为 9 nM），符合对 TS 的紧密结合与强力抑制。核苷酸失衡会提高 dUTP/dTTP 比值，导致尿嘧啶掺入、无效碱基切除修复循环、复制叉停滞与 S 期检查点激活，这是胸苷酸压力的典型表型 [1]。

在 DNA/RNA 合成通路中，TS 将嘧啶代谢与叶酸一碳代谢耦联：上游由丝氨酸羟甲基转移酶生成 5,10‑亚甲基四氢叶酸；下游 dTMP 磷酸化为供 DNA 聚合酶使用的 dTTP；二氢叶酸还原酶与胸苷挽救途径共同维持辅因子与产物平衡。Raltitrexed 选择性阻断从头合成的胸苷酸生成，使 DNA 复制特异性受限，而对 RNA 合成影响相对较小，这是选择性耗竭 dTTP 的直接结果 [1,2]。

在包括 L1210 白血病细胞在内的体系中，Raltitrexed 常用于施加可控的胸苷酸缺陷，用以精确诱导复制压力与 DNA 损伤反应。研究者据此：解析对 TS 活性与一碳代谢的依赖；量化核苷挽救与叶酸转运的代偿；剖析 S 期检查点与复制叉动力学；并跟踪 dUTP/dTTP 比、TYMS 表达和 γH2AX 等胸苷酸压力标志物。由于其在核苷抗代谢物/类似物类别中具备针对 TS 的机制特异性，Raltitrexed 可作为高保真探针，用于归因由 TS 阻断引发的表型并构建从头 dTMP 通路的功能与耐受网络 [2]。

■ 2. 文献分享
■ 2.1 Thymidylate synthase inhibitory drugs induce p53-dependent pathways differently.

▲(A, B) 基于 18 个样本的长链 RNA 测序数据，展示了 HCT116、HCT116-UGI 及 HCT116-MMR-UGI 细胞系在 化合物 RTX 或 5FdUR 处理后显著上调 (A) 与下调 (B) 基因的交集与特定集合。图例颜色区分了不同条件的基因集：绿色/蓝色分别为 5FdUR 特异性与 RTX 特异性的差异基因集；红色柱及箭头为不同细胞系特异性基因；粉色柱为预期发生强烈修复合成的细胞系中的特异性基因；灰色柱及箭头为碱基切除修复（BER）被抑制的细胞系中的特异性基因；末端深灰色柱为各处理条件间共有的上调或下调基因。

Raltitrexed (T6632) 在不同尿嘧啶-DNA修复背景的HCT116衍生细胞中引发可观的转录组变化。其诱导的差异在HCT116与HCT116-MMR-UGI中较HCT116-UGI更为明显，提示细胞背景会影响其转录组反应幅度。就高表达蛋白编码基因而言，Raltitrexed 引发的整体变化幅度普遍小于5FdUR，但在各表达区间内，Raltitrexed 与5FdUR处理样本之间仍呈现稳定且一致的差异。这些药物特异性的差异在HCT116-MMR-UGI中尤为突出，其中Raltitrexed 诱导的表达谱更接近HCT116-UGI，反映出失配修复缺失使其反应模式向UNG受抑背景靠拢。在p53信号通路的网络映射中，还观察到Raltitrexed 的特征性信号：Siva-1 被鉴定为展示的唯一Raltitrexed 偏倚基因，且其可抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白。上述结果表明，Raltitrexed 可在不同DNA修复状态下以条件依赖的方式调控基因表达，相较5FdUR整体转录组改变幅度更小，但呈现可复现的差异性模式，并在p53调控网络中显示出以Siva-1为代表的偏倚特征。[3]

▲ (A) 小鼠 Hepa1-6 肝癌皮下成瘤模型构建流程示意图。(B) 肿瘤生长曲线显示，与未处理组相比，mCAP 处理组的肿瘤体积在给药后受到显著抑制。(C) 离体肿瘤实物图及最终体积统计进一步证实，化合物 mCAP 具有极强的抑瘤效果，最终肿瘤体积缩小了近 80%。(D) H&E 染色显示，mCAP 组肿瘤组织出现明显的细胞坏死和结构破坏。(E) 肿瘤组织内亚铁离子（Fe²⁺）水平检测表明，mCAP 化合物处理显著提高了肿瘤局部的 Fe²⁺ 蓄积，提示其抗肿瘤机制可能与诱导铁死亡（Ferroptosis）相关。

Raltitrexed (T6632) 被描述为一种TYMS特异性抑制剂。在肝癌细胞中，经CCK-8 48小时测定获得其效力，并计算出Hepa1-6与HepG2的IC50分别为10.42 μM与10.91 μM。Raltitrexed 处理使两种细胞系内的ROS与Fe2+水平均升高。透射电镜显示，Raltitrexed 处理的肝癌细胞出现铁死亡的典型形态学特征；具体表现为线粒体收缩减少、线粒体膜密度增加以及嵴减少或缺失。铁死亡相关分子指标亦被调控：Raltitrexed 显著升高细胞内MDA水平与ACSL4蛋白表达，并降低Hepa1-6与HepG2中的GSH水平。机制方面，Raltitrexed 通过TYMS抑制激活NOX，在小鼠与人源肝癌细胞系中显著提高NOX活性，并直接升高NOX关键调控亚基p67 phox 的表达。对NOX的药理学干预进一步支持这一联系：选择性NOX抑制剂VAS2870可一致性削弱由Raltitrexed 引发的ROS累积、Fe2+升高及铁死亡表型，DPI亦可抑制Raltitrexed 诱导的铁死亡特征。以上结果共同表明，Raltitrexed 在肝癌细胞中诱导铁死亡。[4]

Raltitrexed 通过选择性抑制胸苷酸合成酶（TS），占据叶酸结合位点并稳定酶‑dUMP复合物，阻断dTMP的合成，导致关键的dTTP储备下降，抑制DNA合成与修复。此机制引发核苷酸失衡、复制叉停滞及S期检查点激活，表现出典型胸苷酸压力。文献报道中，Raltitrexed与奥沙利铂联合用于肝细胞癌肝动脉灌注，表现出缩短灌注时间和提升耐受性的优势；其在不同DNA修复背景细胞中调控p53依赖的基因表达，且在肝癌细胞中通过抑制TYMS激活NOX诱导铁死亡，揭示了核苷酸代谢与氧化应激细胞死亡的联系。腹腔灌注用于结直肠癌患者则显著降低肿瘤标志物并改善疾病缓解率，安全耐受性良好。未来研究可聚焦于Raltitrexed诱导铁死亡机制的肿瘤治疗潜力，优化联合治疗方案，并在不同肿瘤遗传背景下深入探讨TS抑制的分子机制，推动精准肿瘤治疗的发展。

Q1: Raltitrexed 是如何通过生化机制抑制DNA合成的？

A1: Raltitrexed 通过占据胸苷酸合成酶（TS）的叶酸结合位点并稳定酶‑dUMP复合物，阻断5,10‑亚甲基四氢叶酸向dTMP的单碳基团转移，导致dTMP及dTTP储量下降，从而抑制DNA合成与修复。

Q2: 文献中Raltitrexed对肝细胞癌细胞的影响有哪些？

A2: Raltitrexed作为TYMS特异性抑制剂，在肝细胞癌细胞中提升ROS与Fe2+水平，诱导铁死亡特征（线粒体形态变化、MDA和ACSL4上调，GSH降低），并激活NOX信号通路，NOX抑制剂能减弱这些效应，证明其诱导肝癌细胞铁死亡。

[1] Carreras CW, Santi DV, et al. The catalytic mechanism and structure of thymidylate synthase. Annu Rev Biochem. 1995;64:721-762.

[2] Wilson PM, Danenberg PV, et al. Thymidylate synthase: a target for cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2014;11(5):282-298.

[3] Holub E, Szajkó M, Felföldi A, Vértessy B, Békési A. Thymidylate synthase inhibitory drugs induce p53-dependent pathways differently.. PloS one. 2026;21(7):e0332491.

[4] Yang R, Chang Y, Feng Z, Yang J, Sun Q, Wang H, et al.. Metronomic Capecitabine Triggers Ferroptosis in Hepatocellular Carcinoma Cells Through Inhibition of TYMS.. Cancer medicine. 2026;15(5):e71898.