抗药抗体(ADA)检测方法及预处理技术汇总

引言

生物药前景广阔，但其诱导产生的抗药物抗体（ADA）会带来一系列危害，因此相关检测不可或缺。本文将系统介绍ADA的产生机制、预处理方法和检测方法。

一、为什么会产生ADA？

ADA全称Anti-Drug antibody，即抗药物抗体，顾名思义是针对药物产生的抗体。我们的免疫系统会识别并消灭外来物质—例如各种病原体（细菌、病毒）。当蛋白类药物进入人体后，免疫系统会将它们误判为入侵的外来物质，制造针对它们的抗体。也就是说，ADA是免疫系统在对药物产生免疫反应时产生的抗体。

二、ADA是怎样形成的？

（1）抗原识别与捕获：治疗性药物进入体内后，被免疫系统识别为“外源抗原”。树突状细胞（DC）等抗原呈递细胞捕获药物，将其加工成肽段，并通过MHC II类分子呈递给初始CD4+ T细胞。

（2）T细胞激活：呈递的抗原肽与T细胞受体（TCR）结合，并在共刺激信号的辅助下，初始T细胞被激活，转化为活化T细胞，并分泌细胞因子。

（3）B细胞激活与分化：活化T细胞与B细胞相互作用，为B细胞提供激活信号。B细胞被激活后，增殖并分化为浆细胞（效应B细胞）。

（4）抗体分泌：浆细胞合成并分泌针对该药物的特异性抗体，即ADA。其中，高亲和力的ADA（如IgG、IgE）的生成通常依赖于T细胞，低亲和力的ADA（如IgM）的生成部分可非依赖T细胞直接激活B细胞。

图片：抗药物抗体的产生机制

三、为什么一定要检测ADA?

ADA可能造成的诸多危害：

（1）加速药物清除：部分ADA与药物结合后形成免疫复合物，会被免疫系统快速清除，导致药物的血药浓度下降、半衰期缩短，从而降低药物暴露量，导致疗效减弱。

（2）中和药物活性：部分ADA（Nab中和抗体）能直接结合药物的活性位点，阻断药物与靶点的结合，导致药物完全或部分失去疗效，引发原发性或继发性耐药，严重时会导致治疗失败。

（3）引发过敏反应：ADA与药物结合后可能引发免疫系统的异常反应；若药物蛋白与人体内源性蛋白结构类似，ADA可能会错误结合人体自身蛋白，引发自身免疫样损伤。

（4）加重药物毒性：ADA与药物结合后形成免疫复合物，这些免疫复合物在体内沉积，可能引发炎症反应，增加肝脏、肾脏的负担。

ADA检测的实际应用场景：

四、如何开展ADA检测？

ADA检测方法多样，各有优劣：ELISA操作简便，但背景偏高、药物耐受性弱；SPR可测浓度和相对亲和力，但设备昂贵；放射免疫沉淀价格低廉，但存在放射性风险；TR-FRET均相免洗，但基质干扰明显。

ECL法操作类似ELISA，兼具低背景、高灵敏、宽线性范围，可以改善药物耐受与基质干扰，目前已成为生物药ADA检测的主流平台。

ECL直接法&桥联法

直接法：

（1）包被：将含有ADA的待测样本固定在电极表面。

（2）检测：加入钌标标记抗体，使其结合ADA，孵育后通过电化学反应产生光信号，从而定量ADA。

桥联法：

（1）包被：将药物固定在电极表面。

（2）孵育：加入含有ADA的待测样本，使样本中的ADA与包被的药物结合。

（3）检测：加入钌标标记抗体，使其结合ADA，孵育后通过电化学反应产生光信号，从而定量ADA。

ECL pSTAT3终点法

当机体内没有产生NAb时，药物PF-07314470激活IL-27R，JAK/STAT3通路磷酸化、信号强；产生NAb时，药物被中和，pSTAT3信号显著减弱，因此可以通过检测STAT3的磷酸化强度来检测中和抗体含量。

步骤1：建立稳健的细胞响应体系

（1）建立细胞系：CHO细胞系、过表达人IL-27RA与gp130的CHO细胞系。

（2）样本血清+药物预孵育：如果样本存在NAb，NAb结合药物后会阻断药物和细胞受体作用。

（3）将混合样本加到细胞里孵育：如果药物活性被抑制，则细胞分泌的pSTAT3减少。

步骤2：ECL法检测细胞上清液中的STAT3、pSTAT3

（1）包被：将抗STAT3、pSTAT3的捕获抗体包被在电极表面。

（2）孵育：加入待测样本，孵育一段时间，使待测样本与捕获抗体结合。

（3）检测：加入钌标标记抗体，孵育后通过电化学反应产生发光信号，从而定量STAT3、pSTAT3。

（4）计算：计算STAT3/pSTAT3比值，得出STAT3的磷酸化程度，从而反映中和抗体浓度。

来自国家药品监督管理局药品审评中心2021年3月修订的《药物免疫原性研究技术指导原则》

了解完常用的ADA检测方法学，再来看看预处理的方法学吧！

预处理是为了获得被富集和纯化过的ADA，避免待测样本中含有高浓度的药物以至于掩盖ADA信号。通常利用低pH条件破坏ADA-药物复合物的亲和力，获得游离化的ADA。

ADA预处理方法学

方法一 直接酸解离：

①将待测样本与酸解液混合孵育，直接解离ADA-药物复合物，从而获得游离状态的ADA

方法二 亲和捕获洗脱（ACE）：

①向待测样本中加入酸解液，使ADA从ADA-药物复合物中解离释放，随后将释放的ADA转移至包被有药物的微孔板中

②利用固相化药物对ADA的特异性亲和力，来捕获ADA

③再次加入酸解液进行二次解离，使ADA从固相药物上释放，最终获得游离状态的ADA

方法三 固相提取和酸解离（SPEAD）：

①向待测样本中加入酸解液，使ADA从ADA-药物复合物中解离释放

②加入生物素化药物，使其与释放出的ADA特异性结合

③将结合产物转移至链霉亲和素包被的微孔板中，实现固相捕获

④再次加入酸解液进行二次解离，使ADA从固相载体上释放，最终获得游离状态的ADA

方法四 磁珠提取和酸解离（BEAD）：

①向待测样本中加入酸解液，使ADA从ADA-药物复合物中解离释放

②将释放液转移至包被有生物素化药物的链霉亲和素磁珠板上，由固相化药物对ADA进行特异性捕获

③再次加入酸解液进行二次解离，使ADA从磁珠上释放，最终获得游离状态的ADA

方法五 沉淀和酸解离（PandA）：

①向含ADA的血清中加入过量药物，使ADA与药物结合形成ADA-药物复合物

②加入PEG，使复合物沉淀析出

③洗涤沉淀，去除未结合的游离药物

④对沉淀进行酸解离，使ADA从复合物中释放，最终获得游离状态的ADA

五、ECL法需要什么？

试剂耗材：

仪器设备：

MSD仪器

参考文献

[1] Kolganova, M. A., Melnik, E. V., et al. Affinity Capture Elution (ACE) ELISA Method Development and Validation for Novel RPH-104 Drug Immunogenicity Evaluation.2022.

[2] Solid Phase Extraction with Acid Dissociation (SPEAD) Method For Mitigation of Drug Interference: Biochemistry.2021.

[3] Niu, H., Klem, T., Yang, J., Qiu, Y., & Pan, L.A biotin-drug extraction and acid dissociation (BEAD) procedure to eliminate matrix and drug interference in a protein complex anti-drug antibody (ADA) isotype specific assay. 2017. 

[4] Weaver, R., McMahon, H., & Dunn, S. A Comparison of SPEAD and BEAD Sample Pre-Treatment to Improve Residual Drug Tolerance in a Cell-Based NAb.2020.

[5] Zoghbi, J., Xu, Y., Grabert, R., Theobald, V., & Richards, S. A breakthrough novel method to resolve the drug and target interference problem in immunogenicity assays.2015.