10色流式方案在同步检测人PBMCs增殖、活力与T细胞激活中的优势及应用

做细胞实验最头疼的是什么？样本少不够用、一次实验只能测一个指标、数据干扰多结果不准…… 别担心，Bio-Rad全新验证的流式细胞术方案来了，让这些问题一次性解决！

一管样本=4份数据，效率直接拉满

在细胞实验中，样本量往往是限制研究进度的关键。尤其是珍贵的人类外周血单个核细胞（PBMCs），每一滴都来之不易。Bio-Rad这款经过严格验证的实验方法，创新性地将细胞增殖、细胞活力、激活状态、免疫表型四大核心参数整合进单次实验。

无需分样、无需重复操作，借助CytoTrack细胞增殖试剂盒、VivaFix细胞活力检测试剂和StarBright™染料偶联抗体，一次就能获取多维数据。既节省了宝贵样本，又减少了实验误差，让每一份样本都发挥最大价值，大大缩短研究周期～

三大核心试剂加持，数据质量再升级

能实现多参数同步检测，离不开三款 “神级试剂” 的强强联合，各自身怀绝技：

1. CytoTrack Green：细胞增殖的 “精准记录仪”

作为无毒的细胞内蛋白结合染料，它有三种荧光选择，能随着细胞分裂逐代降低荧光强度，最多可清晰识别10次细胞分裂！实验中4天内就能捕捉到5次细胞分裂过程，让细胞增殖轨迹一目了然，数据稳定又可靠。

2. VivaFix细胞活力染料：死细胞的 “精准筛除器”

死细胞的自发荧光和非特异性结合是数据干扰的 “重灾区”。VivaFix提供7种荧光选择，活细胞中仅结合细胞表面伯胺，死细胞中则穿透破损细胞膜结合胞内伯胺，荧光强度差异显著，轻松区分活死细胞。

更关键的是，它激发和发射谱带窄，相比DAPI、PI等DNA结合染料，大幅减少补偿和信号扩散，让数据质量直线提升，还支持染色后固定，实验灵活性拉满～

3. StarBright 染料偶联抗体：信号检测的 “超强放大器”

抗体是免疫表型和激活状态检测的核心，StarBright染料凭借亮度高、激发发射谱带窄的优势，让细胞群体分辨度达到新高度。

实验中用到的CD25、CD69（激活标志物）、CD45RA/RO（naive/memory T细胞标志物）等抗体均偶联该系列染料，即使是低抗原密度或表达不稳定的标志物（如 CD25），也能呈现清晰的阳性 / 阴性群体分离，无明显信号溢出和扩散。

实验设计超贴心，新手也能轻松上手



除了试剂给力，这套方案的实验设计也处处体现 “实用主义”：

适配5激光ZE5细胞分析仪，充分利用激光资源，最小化信号干扰，搭配Bio-Rad的多色panel构建器和荧光光谱查看器，轻松完成panel设计；

提供两种T细胞刺激方式（CD3/CD28抗体涂层、CD3/CD28 T细胞激活剂），搭配未刺激细胞作为阴性对照、FMO对照、单染对照等多重验证，结果更可信；

染色仅需PBS和BSA缓冲液，无需特殊试剂，步骤清晰，抗体均经过滴定优化，直接使用最佳稀释度即可。

检测组合设计

每种抗体/试剂均有多种荧光团选择，因此检测组合的排列方式多样。为获得高质量数据并高分辨率识别所有细胞群，本研究遵循检测组合设计的最佳实践，并利用伯乐的多色组合构建工具和荧光光谱查看工具辅助荧光团选择。具体考虑因素如下：

检测在5激光ZE5细胞分析仪（伯乐公司，产品目录号12004279）上进行。通过《伯乐流式细胞术荧光团和活力染料指南》确定了可被最佳激发和检测的染料 / 荧光团及其相对亮度。由于使用了所有5种激光，将抗体和染料分布在所有可用激光上有助于最大限度减少溢漏和扩散。

选择能够解答生物学问题的标志物，并确定其抗原密度水平。部分标志物（包括CD25和CD69）的表达水平会因细胞活化状态而异。

对于抗体，尽可能将亮度高的荧光团与抗原密度低或表达水平可变的标志物配对。由于本检测组合相对较小，所使用的所有荧光团均具有中高亮度（在1-5分评分体系中得分为3-5分，5分为最亮）。同时仍遵循最佳实践，将亮度较高的荧光团与抗原密度低的标志物配对，反之亦然。

通过将染料和荧光团分布在5种激光上，最大限度减少溢漏和扩散。此外，所选组合的设计可最大限度减少对检测组合中其他染料和荧光团所用检测滤光片的溢漏。对于表达水平未知或可变的标志物（如CD25），所用荧光团需具有低扩散特性，因此将CD25与SBUV400配对。SBUV400是一种亮度高、激发和发射光谱窄且无溢漏或扩散的染料（补充表1和表2）。最终荧光团和染料的光谱图见图1，检测组合详情见表1。

结果

十色检测组合的验证结果表明，所有细胞谱系和标志物均可被识别。从活的单个细胞中可清晰识别主要T细胞群，各谱系中的多个亚群也能被明确区分。

图2显示了经CD3和CD28抗体刺激的PBMCs的完整门控策略，同时展示了来自相同细胞的CD25和CD69 FMO组合的散点图。图2经CytoTrack Green、VivaFix和StarBright染料偶联抗体染色的受刺激PBMCs的完整门控策略。识别出主要淋巴细胞群以及活化标志物和细胞增殖情况。数据在ZE5细胞分析仪上采集。

为验证细胞刺激是否有效，本研究比较了未受刺激样本与两种不同方法刺激的样本：用CD3抗体包被并与抗CD28抗体和IL-2共同孵育，或用CD3/CD28 T细胞激活剂包被并与IL-2共同孵育（后者同样基于抗体），结果见图3。未受刺激的细胞在4天培养期内几乎未发生增殖，仅检测到一次细胞分裂；而受刺激的细胞可观察到五次分裂。正如预期，未受刺激的T细胞未表达CD25，初始CD4⁺和CD8⁺细胞比例较高，且CD69表达水平较低。两种刺激方法均有效；然而，使用 CD3、CD28抗体和IL-2刺激时，更多细胞进入后期分裂阶段，且表达CD25和CD69的细胞比例更高，这表明该方法对 T细胞的刺激效果更优。

对数据的深入分析揭示了不同T细胞群的增殖和活化特征。首先，比较了淋巴细胞、CD3⁻细胞、CD3⁺T细胞以及CD4⁺（辅助性T细胞）和CD8⁺（细胞毒性T细胞）的增殖速率（图4）。在各细胞群门控后，利用CytoTrack Green散点图确定每个细胞分裂阶段的细胞百分比。在淋巴细胞门控中，与 CD3⁻细胞（包括非T细胞，主要为B细胞和自然杀伤细胞）相比，CD3⁺细胞的分裂次数更多。这一结果符合预期，因为所采用的刺激方法针对T细胞激活剂。T细胞 CD4⁺和CD8⁺亚群之间也存在差异，CD8⁺细胞进入后期分裂阶段的比例更高。此外，观察到CD8⁺细胞数量的扩增程度高于CD4⁺细胞。这与已发表的研究数据一致，即T细胞活化后，CD8⁺细胞的增殖速率高于CD4⁺细胞（Seder和Ahmed，2003）。

图3经CytoTrack Green、VivaFix和StarBright染料偶联抗体染色的未受刺激和受刺激PBMCs的比较散点图。识别出主要淋巴细胞群、活化标志物和细胞增殖情况。与未受刺激细胞相比，受刺激细胞的活化特征明显。数据在ZE5细胞分析仪上采集。SBUV=StarBright紫外；SBV=StarBright紫；SBY=StarBright黄。
图4 T细胞活化后，CD8⁺T细胞的分裂速率高于CD4⁺T细胞。A：显示所有淋巴细胞以及CD3⁻、CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞群中CytoTrack Green染色特征的散点图。门控显示每个细胞分裂阶段。B：A图中各细胞分裂阶段的细胞百分比。PBMCs经CD3和CD28抗体刺激。数据在ZE5细胞分析仪上采集。（■）=淋巴细胞；（●）=CD3⁻细胞；（▲）=CD3⁺细胞；（▼）=CD4⁺辅助性T细胞；（◆）=CD8⁺细胞毒性T 细胞。

由于免疫表型组合中包含多种标志物，本研究通过分析每个细胞分裂阶段的细胞获得了更多信息。随着细胞分裂，CD25⁺细胞数量稳步增加，而 CD69⁺细胞数量在一次细胞分裂后迅速增加，随后下降（图5A）。CD3⁺、CD4⁺和 CD8⁺细胞群的变化趋势相似（图5B）。结果与已发表数据一致：CD69是早期T细胞活化标志物，在T细胞增殖和存活中发挥作用，其在活化后迅速升高，随后逐渐降至基础水平；而CD25是晚期T细胞活化标志物，对细胞活化应答至关重要。

本研究还测定了每个细胞分裂阶段初始（CD45RA⁺）和记忆（CD45RO⁺）T细胞的百分比（图5B）。随着细胞分裂，记忆T细胞的比例逐渐增加。这一结果符合预期，且与已发表数据一致，验证了本方案的有效性。CD45RO表达于已接触抗原的T细胞，或在本研究中，通过CD3和CD28抗体进行抗原非依赖性刺激的T细胞，该刺激可激活T细胞受体复合物，模拟抗原呈递细胞的刺激作用（Trickett和Kwan，2003）。

图5细胞刺激后，随着细胞分裂，初始和记忆T细胞百分比以及T细胞活化标志物的变化。测定未受刺激和受刺激细胞在每个分裂阶段中，CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞表达CD25、CD69、CD45RA（初始标志物）和CD45RO（记忆标志物）的百分比。A：CD3⁺细胞的代表性散点图。B：CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞的数据图表。PBMCs经伯乐CD3和CD28抗体刺激。数据在ZE5细胞分析仪上采集。SBUV=StarBright紫外；SBY=StarBright黄；（■）=CD3⁺细胞；（●）=CD4⁺辅助性T细胞；（▲）=CD8⁺细胞毒性T细胞。

通过这套方案，研究团队得出了诸多有价值的结论，完美验证其科学性：

染色方案表明多种试剂可协同发挥良好作用。CytoTrack、VivaFix和StarBright染料偶联抗体在同一实验中均得到有效应用，生成了高质量数据。

抗体组合在PBS和BSA中进行染色，无需特殊缓冲液。

该检测组合具有高细胞分辨率，所有细胞群均可被清晰识别，且溢漏和扩散水平低。

所用抗体产生的信号亮度高，所有具有双峰信号（明显的阳性和阴性细胞群）的抗体均能实现两个细胞群的清晰分离。

CytoTrack Green可识别多次细胞分裂——本实验中，细胞在4天培养期内完成了5次分裂。

两种细胞刺激方法均有效。与使用T细胞激活剂试剂活化的细胞相比，CD3/CD28抗体可使更多细胞活化，且细胞分裂次数更多。

CD3、CD4和CD8免疫表型标志物可提供T细胞群的特异性信息。CD8⁺（细胞毒性T细胞）亚群的细胞分裂速率高于CD4⁺亚群（辅助性T细胞）。

利用CytoTrack Green可轻松对每个细胞分裂阶段的细胞进行门控，从而获取特定分裂阶段的细胞信息。正如预期，随着细胞分裂，初始细胞比例下降，记忆细胞比例增加。同时清晰识别出表达活化标志物CD28和CD69的细胞数量变化：CD69⁺细胞数量减少，而 CD25⁺细胞数量随每次分裂略有增加。

本研究成功开发并验证了一种方法，可在人PBMCs刺激后对多种细胞参数进行定量分析，生成的结果与现有文献一致。将多种检测整合为一项实验，不仅节省了时间和样本，还能获取大量信息。

总结

无论是基础研究中的T细胞功能分析，还是临床样本的多参数检测，这套整合式流式细胞术方案都能凭借样本用量少、数据维度全、结果精准可靠、操作简单灵活的优势，帮你高效推进研究。

数据来源： 

bio-rad-antibodies.com/static/2025/flow/bulletin-3779-validated-method-to-measure-multiple-parameters-in-stimulated-human-peripheral-blood.pdf

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