使用显微镜时为什么要用到显微镜浸油？

使用显微镜时为什么要用到显微镜浸油？
 
一、为什么要了解浸油
大多数使用显微镜的人并不是显微镜专家——他们有自己的专业领域，对显微镜的了解仅限于"在岗培训"中能应付工作的程度。显微镜对他们而言是工具而非研究对象，因此关于如何正确使用这件"工具"的背景知识往往是欠缺的。
本文旨在帮助使用者理解显微镜在聚光镜与物镜之间的这段"业务区间"——也就是浸油物镜发挥作用的区域，并介绍浸油的各项性能特性，以及如何更充分地利用它们。
二、浸油的作用：提升分辨率与亮度
浸油对显微镜成像的贡献体现在两个关键指标上：分辨率和亮度。这两个指标在高倍放大下尤为重要，因此通常只有高倍短焦距物镜才需要浸油。
油浸物镜的规格通常在 40x 到 120x 之间。注意不要把它和"高干"物镜或水浸物镜混淆——正如油浸物镜必须配油使用、水浸物镜必须配水使用一样，干物镜必须干燥使用。在高干物镜上用油会破坏球面和色差校正，彻底毁掉图像。
 
（一）孔径角与数值孔径
对于任意给定的镜头，焦距是固定的。物镜聚焦在标本上一点后，从该点发出的光线在物镜前方形成一个光锥，光锥的锥角就是孔径角（Angular Aperture, A.A.）。
 
孔径角：示意图对比了30°低倍干物镜与118°高倍油浸物镜。
 
图 1
 
光线 R1—— 均匀光程下的直线光线（光学系统已浸油）。光线 R2—— 空气间隙引起的光线偏折。注意 R1 比 R2 起源于更倾斜的角度，在标本处形成更大的孔径角，说明到达物镜的光更多，分辨率更高。R1a 和 R1b 标示了未浸油时可能发生反射的位置，R1c 和 R1d 标示了未浸油时折射导致光损失的位置。假设封固剂的折射率与载玻片和盖玻片相同。
 
图 2
在标本下方，聚光镜顶部是第二个匹配的光锥顶点，理论上提供从聚光镜到物镜的直线路径。这条直线路径会被任何不同折射率的材料打断。理想情况下：聚光镜（折射率≈1.00，空气）→ 载玻片（≈1.515）→ 封片剂（≈1.515）→ 盖玻片（≈1.515）→ 物镜（1.515）。
由于大多数聚光镜和物镜透镜的折射率约为 1.515，用浸油（折射率 1.515）填充空气间隙，就能获得从聚光镜到物镜的均匀光程。
分辨率直接与孔径角相关——孔径角越大，到达物镜的斜射光线越多，分辨率越高。 Ernst Abbe 提出了数值孔径（Numerical Aperture, N.A.）概念：
N.A. = n × sin(½ A.A.)
其中 n 是光路上最低介质的折射率。对于干燥物镜，n=1.00（空气）；水浸物镜 n=1.33；油浸物镜 n=1.515。由于透镜玻璃的实际限制，N.A. 1.515 的物镜理论最大 N.A. 为 1.40——使用浸油才能充分发挥物镜的分辨能力。在相同焦距下，油浸物镜比干物镜的分辨率高出约 50%。
（二）聚光镜也需要"浸油"
不仅物镜需要浸油才能发挥全部 N.A.，聚光镜同理。聚光镜 N.A. 1.40 时，必须使用折射率 1.40 以上的介质（如浸油 1.515）才能达到设计 N.A.。聚光镜与载玻片底面之间的空气间隙会将有效 N.A. 限制在 1.0。
一个光学系统的实际分辨率由物镜 N.A. 和聚光镜工作 N.A. 的平均值决定。只有物镜和聚光镜都按设计条件使用（干、水浸或油浸），系统才能达到标称性能。
三、浸油的理想特性
多年来，行业一直在推进浸油光学性能的标准化，因为浸油已成为显微镜光学系统不可分割的一部分。获得最高质量图像，取决于显微镜设计中所依赖的浸油性能一致性。
第一步标准化由德国工业标准 DIN 58884 完成——目前欧美主流浸油均符合该标准。国际标准化组织（ISO）也正在制定更国际化的标准，基本与 DIN 一致。
（一）折射率
浸油的折射率通常在一个特定波长下标定——一般选用汞绿线（e 线，5461 Å），因为这是可见光光谱中人眼最敏感的波段。按 DIN/ISO 规定，通用浸油在 e 线处的折射率应为 1.5180 ±0.0004（DIN）/ ±0.0005（ISO）。
（二）色散匹配（阿贝数）
浸油不仅要在 e 线处折射率匹配，还必须在整个可见光波段与光学玻璃的色散特性匹配。色散通常用阿贝数 ν（色散系数）表示：
ν = (nD - 1) / (nF - nC)
DIN/ISO 规定通用浸油的阿贝数应为 νe = 44 ± 5。
配制浸油的主要难题就在于此——不仅要在 e 线处折射率匹配，还要找到色散值同样接近的材料，使整个可见光光谱内色散都紧密匹配。迄今为止，还没有任何一种浸油能完美匹配显微镜的光学玻璃。最接近的天然匹配物是加稠柏木油，它曾长期被广泛使用——但缺点是：吸收蓝光和紫外光、随时间变黄、因不均匀挥发而在物镜上硬化、有酸性、以及溶剂挥发导致折射率和色散漂移。

Cargille 合成浸油的优势：现代合成浸油彻底消除了柏木油的所有缺点。Cargille 从 1940 年代即开始研发非干性浸油和低荧光浸油，是全球第一家提供 PCB-free 浸油（1971 年）的厂商。

（三）温度系数
温度是经常被忽视的因素。液体的折射率随温度升高而降低，温度系数约为每 °C 变化 0.0004。室温与标定温度（23°C）之间的差异会导致折射率出现明显偏差。
大多数厂商的标准标定温度为 23°C（74°F），部分特殊产品标定在 18°C、20°C 或 37°C。23°C 这个标定值之所以高于理想室温（22.2°C），是因为考虑到显微镜灯箱和照明系统的散热会使载物台温度略高于室温。
当需要在 D 线以外的波长下工作时（如绿线 5461 Å、蓝线 4358 Å 或近紫外），可以通过微调油样温度使折射率与玻璃精确匹配。
（四）颜色与吸收
颜色是浸油配方中必须考虑的因素，因为任何颜色都意味着光吸收损失。理想情况下浸油应完全无色透明。颜色的存在是否可接受取决于具体应用——但在紫外或近紫外波段工作时，颜色造成的吸收带会直接影响成像，因此需要专门的低波长浸油。
（五）酸值——保护镜头胶合剂
浸油的酸值必须非常低。合成油的酸值通常低于柏木油。高酸值会腐蚀物镜内部的金属部件，更严重的是会加速镜胶（透镜之间的黏合剂）的降解——镜胶是一个密封层，防止油渗入透镜后端。
一旦镜胶开裂或破损，浸油会通过毛细管作用渗入镜头内部，从后端污染透镜。这种损伤往往是渐进的——当显微镜操作者意识到图像质量下降时，镜头内部可能已经被污染。镜头清洁非常困难，因为后透镜组位置难以触及。

行业常识：镜头制造商在正式批准某款浸油用于其镜头之前，会先将油样在镜头中浸泡 6-12 个月，确认其酸性、油性等特性不会对设备造成任何损害。Cargille 浸油是全球主要显微镜厂商（AO、B&L 等）的指定配套用油。

（六）化学稳定性
合成浸油应不含挥发性成分，配方稳定，不受氧化、光降解或其他分解方式影响。这意味着显微镜使用者可以信赖所用材料的性能始终如一——不因存放时间或光照而漂移。Cargille 的质量控制体系确保产品出厂时的性能与数月后使用时一致。
四、黏度选择指南
黏度的选择主要取决于显微镜操作者的个人偏好和具体应用：

型号	黏度	特点	适用场景
Type A	150 cSt（低）	稀薄，不易裹入气泡；但如果盖玻片到物镜距离很小，低黏度油容易流走	教学实验室、盖物距较大时
Type 300	300 cSt（中）	中等黏度，配合自动化血液分析系统的机械加样结构	全自动血液分析系统
Type B	1250 cSt（高）	黏稠，一滴油可粘附在物镜上连续观察多张切片而不滴漏，可重复使用	批量阅片、病理科、科研实验室
Type NVH	21000 cSt（极高）	专为聚光镜间隙大、长焦距、卧式或倾斜式显微镜及投影显微镜设计	倒置显微镜、投影显微镜、长焦距仪器

Type A、B、300、NVH、OVH 五种油可互相混合调配中间黏度，同时保持相同的光学性能。
 

Type A（粉标） 教学入门款

Type B（蓝标） 科研批量款

Type 300（绿标） 血系配套款

 
五、正确使用浸油
（一）滴油方法
使用带尖头或圆头的滴棒，在已定位好的玻片上滴一滴油。滴棒的圆头可以通过在油瓶瓶口内"刮取"来控制滴量——有经验的操作者一看就知道滴量是否合适。在瓶口内刮滴还能防止油顺着瓶壁外流，避免沾附灰尘和手指油污。
（二）避免气泡
滴油时切忌裹入空气。气泡相当于小透镜，会破坏图像清晰度。避免方法：让油滴接触玻片或聚光镜后，让油从滴棒自然流下，不要反复点触——点触会增加裹入气泡的概率。
（三）聚光镜浸油
聚光镜应在低位时浸油，放好玻片后缓慢升起聚光镜使其与油滴接触。物镜浸油则是：在玻片上滴油，缓慢降下物镜浸入油滴；或使用物转盘，缓慢转动物镜进入油滴位置。光学系统浸油后更换玻片时，物镜上可能残油，需重新滴油。
（四）清洁
干性油（如柏木油、檀香油等天然油）必须在使用后立即擦除——干燥后会硬化，难以清除，可能损伤镜头。
非干性合成浸油可以长期留在镜头上而不损伤镜头（不会硬化），但油面会吸附灰尘，因此仍建议定期擦拭。使用二甲苯（Xylol）配合擦镜纸做最后擦拭，可保持光学系统良好状态。
 
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