杂交瘤HAT筛选：集落生长不良的7项排查要点

摘要：杂交瘤HAT筛选常出现集落稀疏、细胞存活差的问题，成因覆盖细胞、培养基、操作等多个环节。本文区分两个发生阶段，梳理排查要点与验证方法，为单克隆抗体制备实验提供参考。

关键词：杂交瘤、HAT筛选、促杂交瘤生长剂、杂交瘤细胞、集落生长不良、HGPRT缺陷、PEG细胞融合、骨髓瘤细胞、饲养层、单克隆抗体、杂交瘤生长剂

杂交瘤细胞融合后经HAT选择培养获得阳性克隆，是单克隆抗体制备的关键环节。实验中常出现筛选后孔内集落稀疏、甚至无细胞存活的情况，导致实验周期延长与试剂耗材损耗。

该类问题的成因涉及细胞、培养基、操作等多个环节，准确排查需要按发生阶段逐步定位。本文整理了不同阶段的常见原因与对应排查方法，供实验参考。

一、杂交瘤细胞生长不良的两种发生阶段
根据出现时间与表现，可分为融合后早期存活失败与筛选期集落消退两类，二者常见原因与排查方向不同。准确区分发生阶段是定位原因的前提，建议融合后24h进行镜检，记录细胞存活状态、细胞碎片比例，作为后续分析的基线依据。

表1.两类杂交瘤细胞生长不良的特征与可能成因

新融合的杂交瘤细胞同时具备B细胞抗体分泌能力与骨髓瘤细胞无限增殖能力，但细胞稳定性较差，对培养环境敏感，筛选阶段存活率普遍较低。

二、集落生长不良的排查要点
1.融合效率验证
常见原因：细胞融合本身为低效率事件，且对参数高度敏感。PEG分子量与批次、作用时间与滴加速度、融合时细胞密度与活率、融合前亲本细胞的生长状态，均会影响最终融合效率。
验证方法：统计融合后总活细胞数与疑似融合细胞比例，与历史成功批次对比。不建议仅通过最终集落数反推融合效率，中间阶段的细胞状态数据更利于找出问题。
处理建议：固定PEG批号与操作时序，制定标准化操作程序；融合前24h确认两株亲本细胞活率，提前复苏传代骨髓瘤细胞，保证融合当天处于对数生长期。

2.骨髓瘤细胞HGPRT缺陷确认
常见原因：HAT筛选的原理基于骨髓瘤细胞的HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺陷：氨基蝶呤抑制二氢叶酸还原酶（DHFR），阻断嘌呤和嘧啶的从头合成通路；正常细胞可通过补救合成通路，利用次黄嘌呤（HGPRT催化）和胸腺嘧啶脱氧核苷（胸苷激酶催化）合成DNA；HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞嘌呤补救通路失效，无法合成DNA而死亡。

若骨髓瘤细胞长期传代且未维持选择压力，可能发生回复突变，出现HGPRT阳性细胞。这类细胞可在HAT中存活并形成“假集落”，稀释阳性杂交瘤信号。未融合骨髓瘤残留也可能出现类似表现。

验证方法：取待验证骨髓瘤细胞单独铺板，加入HAT培养基连续培养10~14天，观察是否有细胞持续存活。若存在存活细胞，提示细胞群HGPRT缺陷表型丢失。

处理建议：使用8-氮杂鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤重新筛选，维持细胞HGPRT缺陷表型——此类碱基类似物需经HGPRT掺入DNA才能产生毒性，可特异性富集缺陷型细胞。同时建立分级工作细胞库，避免长期连续传代。

图1. HAT筛选的原理

3. 验证HAT培养基质量
常见原因：三类常见问题可导致筛选压力异常：

• 氨基蝶呤浓度偏高，选择压力过强，杂交瘤细胞一同死亡；
• 次黄嘌呤溶解度较低，若粉末溶解不充分，实际有效浓度低于标称值，筛选压力不足；
• 筛选后期未及时换液，基础培养基营养消耗、代谢废物积累、渗透压变化，细胞生长受限。

胸腺嘧啶脱氧核苷水溶性较好，一般不会出现溶解不完全问题。

验证方法：用一株已知HAT耐受的稳定杂交瘤细胞，在待验证培养基中连续培养，绘制生长曲线。该对照可区分问题来源于培养基还是细胞本身。

4.铺板密度与孔板位置效应
常见原因：铺板密度过高或过低均会影响集落形成。密度过低时，单孔内细胞数量少，细胞自分泌的促生长因子被稀释，不足以支持存活增殖；密度过高时，营养与空间竞争会抑制整体生长。

此外，96孔板边缘孔因蒸发速率快，生长表现通常差于内圈孔，其中蒸发是较主要的影响因素。

图2. 孔板边缘效应

验证方法：同批细胞设置3个密度梯度平行培养，第7天统计集落数量；同时对比边缘孔与中心孔的生长差异。

处理建议：将铺板密度纳入标准化操作参数；保证培养箱内湿度，可将培养板置于带盖透气容器中，旁置开盖无菌水皿减少蒸发；板的外圈孔可仅加入PBS或培养基，不铺细胞，或仅使用内圈孔进行实验。

5.饲养层有效性评估
常见原因：饲养层可提供细胞因子与代谢支持，提升低密度下单细胞的存活率，腹腔巨噬细胞是常用的饲养层细胞。但饲养层本身也引入额外变量：细胞来源与制备状态、灭活处理的程度、批次间差异，均会影响支持效果；若饲养层制备质量不佳，反而会竞争营养与空间。

验证方法：设置“加饲养层/不加饲养层/加化学成分限定生长补剂”三组平行对照，除支持物外其余条件保持一致，特别是铺板密度。

处理建议：若对照实验显示饲养层未带来稳定收益，可考虑用化学成分限定的生长补剂替代，减少饲养层制备环节与动物源批次波动。也可采用甲基纤维素半固体培养基，将筛选与克隆步骤合并，获得物理分离的离散集落。

6.血清与培养基组分波动
常见原因：胎牛血清存在天然批间成分差异；培养基中谷氨酰胺在37℃下会持续降解；抗生素浓度偏高也会对分裂活跃的细胞产生影响。

验证方法：使用同一批冻存细胞，仅更换血清批次进行平行培养，可直接判断问题是否来源于血清。

处理建议：每批新血清入库前，通过小规模克隆实验验证适用性；谷氨酰胺建议现配现加，或使用稳定型谷氨酰胺衍生物；抗生素按推荐工作浓度使用，不随意提高浓度。

7.操作环节的隐性影响
常见原因：部分操作偏差单独观察时无明显异常，但累积后可明显影响细胞存活，包括：离心转速偏高或时间过长、PEG稀释时吹打力度过大、培养箱温湿度与CO₂浓度波动、频繁开箱导致的温度波动。

验证方法：比对当前实验操作记录与历史成功批次的参数差异；对离心、过滤、接种等关键步骤设置平行重复样。

处理建议：将离心参数、过滤方式、接种操作纳入标准化操作程序并留存记录。此类问题通常通过操作固化解决，而非更换试剂。

三、筛选阶段的生长支持
若经上述排查未发现明确流程问题，可考虑优化筛选阶段的细胞生长支持条件。

需要说明的是，HAT选择阶段的主要压力来自代谢抑制，而单细胞克隆阶段的主要限制是低密度下细胞增殖能力不足，二者为独立的影响因素。

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流程排查用于识别并修正系统误差，生长补充剂用于提升细胞本身的存活增殖能力，二者适用场景不同，建议先排查后优化。

图3. Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂

四、常见问题说明
Q1：HAT筛选后整块板无细胞存活，是否可以挽救？
若无任何集落形成，孔内无存活细胞时难以从原板直接挽救，建议先通过小规模平行实验验证体系稳定性，再重复正式融合。

Q2：集落数量少但阳性率高，是否需要重做融合？
集落数量少但阳性率高，说明筛选体系本身有效，问题主要在细胞存活数量而非筛选特异性。可优先优化铺板密度与生长支持条件，提升集落数量；同时将已获得的阳性克隆尽早建库，避免扩增过程中丢失。

Q3：HAT培养基中可以同时添加生长补剂吗？
可以。化学成分限定的生长补剂与HAT、常规基础培养基及常用抗生素若无无成分冲突，不影响其他试剂功能。

Q4：饲养层是否可以省略？
饲养层的主要作用是提供细胞因子与代谢支持。若成分明确的生长补充剂可达到同等支持效果，则可省略饲养层制备环节，减少动物源变量。建议通过“加饲养层/不加/替代补剂”的平行对照实验，结合自身体系数据判断。

结语
杂交瘤HAT筛选阶段集落生长不良，可来源于细胞、培养基、操作、支持条件等多方面因素。按上述步骤逐步排查，可定位主要原因并针对性调整；排除流程误差后，可结合生长补充剂进一步优化体系。

本文内容基于公开实验经验与技术资料整理，仅作科研交流参考。杂交瘤筛选效果受细胞系状态、试剂批次、操作条件等多重因素影响，具体请以实际预实验结果为准。上海曼博生物可提供Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂及技术支持服务（点击查看）；该产品仅面向科研用途，不得用于人体临床诊断或治疗。