InnoScan文献解读：非测序芯片荧光酶法 cfDNA 甲基化肺癌检测技术
一、研究背景
肺癌是全球致死人数最多的恶性肿瘤之一。临床现在多用低剂量 CT（LDCT）做肺癌筛查。LDCT 有明显缺陷：CT 影像会检出大量肺部良性小结节，筛查假阳性率很高。NLST 研究显示初次筛查假阳性率为 26.3%，NELSON 试验假阳性率为 19.8%。这会导致不必要的穿刺或手术。小于 2 cm 的结节很难穿刺取样，肿瘤可能在随访期间进展、转移。此外，LDCT 筛查的依从性目前约为60%。
液体活检可以检测血液里的肿瘤分子信号，能弥补 CT 影像的不足。现有肿瘤液体活检大致分两类。第一类需要手术肿瘤组织提取突变位点，例如 Signatera 肺癌检测对复发和残留病检测敏感，但需要肿瘤组织确定肿瘤特异性突变，无法用于没有原发肿瘤样本的人群。第二类依靠循环游离 DNA（cfDNA）甲基化标志物。甲基化特征在肺癌患者和健康人群中差异明显，是很有前景的生物标志物。但许多现有液体活检对早期或低肿瘤负荷癌症的灵敏度不足。与影像联合，是液体活检更现实的切入点。
当前和新兴的 DNA 甲基化检测依赖 DNA 测序。样本富集和制备、准确分类所需的测序深度以及繁琐的计算分析，使这些检测成本较高。因此，这类检测用于筛查或辅助 LDCT 的成本效益尚不明确。本研究提出一种无需测序的微阵列方法，通过酶促荧光标记 cfDNA 甲基化位点，产生差异甲基化信号模式，从而对血浆 cfDNA 进行低成本、准确、特异的肺癌分类。研究用 103 例受试者样本进行验证，可区分 2–4 期肺癌患者和健康人，灵敏度和特异度均超过 90%。InnoScan 1100 是实验中用于扫描杂交芯片荧光信号的设备。
二、实验流程，对应图 1
1. 提取血浆 cfDNA，连接定制接头。
2. 亚硫酸氢盐处理 DNA。未甲基化 C 会转化为 U，甲基化 CpG 序列保持不变。
3. PCR 扩增处理后的 cfDNA。U 位点扩增后变成 T，原始甲基化 CpG 扩增后仍保留 CG 序列。
4. 突变甲基转移酶 M.Mpel 对 CG 位点连接叠氮基团。
5. 点击化学反应连接荧光基团。只有原始样本中的甲基化位点带有荧光信号。
标记完成的 DNA 样本和芯片探针杂交。杂交完成后，使用 InnoScan 1100 扫描仪采集芯片荧光信号。图 2 展示从临床采血到芯片检测的全流程。
1. 临床采集 4–8 mL 外周血。两步离心分离血浆，提取 cfDNA。
2. 完成酶促荧光标记后，取 500 ng 标记 DNA 和 Agilent 60K Human CGH 芯片杂交。杂交条件为 48°C 温和旋转过夜。
3. 清洗芯片，去除非特异性结合 DNA。把芯片放入 InnoScan 1100 扫描仪扫描。
4. Mapix 软件读取扫描荧光数值，进行背景扣除和荧光定量；随后由自建分析流程完成归一化等分析。
芯片上每个探针对应一段基因组区域。探针荧光亮度和原始 cfDNA 在该区域的甲基化水平相关。扫描仪输出完整芯片荧光图片。通过比较肺癌样本、健康对照和差异信号，软件筛选两组信号差异明显的基因组位点。这些位点构成肺癌分类标志物集。
三、InnoScan 扫描数据处理与模型构建
本研究使用 Agilent 60K Human CGH 芯片。芯片覆盖约 6 万个基因组位点，全基因组间隔约 40 kb，在基因体和调控元件区域更密集。InnoScan 1100 扫描得到原始荧光强度数据。研究人员搭建专用数据分析流程，流程分为预处理、标志物筛选和建模三个模块。
第一步是数据预处理。InnoScan 输出的原始信号存在芯片批次和样本间偏差。研究用多项式拟合做归一化处理。超过 99% 的甲基化位点在各组样本中信号稳定。软件以稳定位点或芯片内部校准探针为内参，校准整张芯片亮度。两张芯片校正后样本相似度超过 99%。实验分组时，每张芯片均衡放置肺癌和健康样本。研究在不同芯片和不同时间进行多次实验，以区分真实生物学信号和技术误差。训练集和测试集都不是只来自某一张芯片、某一次实验或某一个批次，而是从所有用过的芯片/批次中都抽取了样本，并且两个集合的样本来源分布尽量一致。第二步筛选差异甲基化标志物。研究设定筛选标准：两组样本甲基化差异大于 20%，统计 p 值小于 0.01。最终筛选出 150–200 个特征，实际用于区分的是 170 个差异基因组区域。建模训练集包含 21 例健康人、22 例肺癌患者。分类规则较简单：待测样本每个标志物的甲基化数值与训练集均值对比。数值靠近健康组记 1 分，靠近肺癌组记 0 分。累加全部标志物分数，用固定阈值区分健康、肺癌人群。
随后，研究使用独立验证集进行盲测。验证集包含 29 例肺癌和 31 例健康 cfDNA 样本，未参与训练。根据甲基化谱，每个样本被赋予分数，分类为健康或肺癌。灵敏度和特异度由盲测结果计算，用于评估诊断准确性。
四、盲测验证核心结果
研究建立独立盲测数据集。数据集包含 29 例肺癌、31 例健康对照。全部芯片经 InnoScan 1100 扫描。扫描数据生成 170 个标志物甲基化热图，对应见图 3a。热图清晰区分健康对照组和肺癌患者组。绿色标记代表早期肺癌样本，黑色标记代表分类错误样本。基于 InnoScan 采集的荧光信号绘制 ROC 曲线，对应图 3b。
在 2–4 期肺癌与健康对照组的盲测中，整套检测方法最优性能指标如下：检测灵敏度 93.1%，特异度 90.3%，曲线下面积 AUC = 0.947。需要注意，本次研究对照仅选用健康人群，真实临床场景需要区分肺癌和良性肺部结节。真实场景特异度可能低于本次数值，或说本次特异度可能高估。但 InnoScan 稳定采集的荧光数据，证明这套无测序检测方法具备进一步开发潜力。
研究额外开展肺癌亚型区分实验。NSCLC 队列包括腺癌 32 例和鳞癌 17 例。将鳞癌特征与 22 例年龄匹配的腺癌患者特征独立比较，筛选出 168 个亚型专属甲基化标志物。这些标志物未包含在癌症/健康分类器中，可区分肺腺癌和肺鳞癌，亚型分类 AUC = 0.881。鳞癌样本正确分类率 86.4%，腺癌样本正确分类率 88.2%。
机制验证方面，研究分析了差异 panel 涉及的基因和生物学通路。由于许多标志物位于基因编码区外，研究使用 GREAT 通过邻近关系或 cis 调控元件功能解释生成相关基因列表。其中包括肺癌中已知的癌基因驱动因子和抑癌基因，如 BRAF、CDKN2B、SMART、RICTOR，以及若干个 EMT/转移调节因子，如 SNAI、Vimentin、ROCK、TRIB、FYN。随后使用 DAVID 进行信号通路富集。严格分析后得到两个高度显著的通路：发育蛋白（UniPort: KW-9996 & KW-0217）和 cAMP 信号通路（UniPort: hsa04024）。发育模块包含 WNT/β-catenin 信号，涉及 TCF7L2 等基因；cAMP 信号相关标志物包括 GNAS 和 VIPR1。
五、InnoScan 数据用于疗效动态监测
初步证据显示，该检测有潜力作为影像的分子补充，监测 NSCLC 患者的治疗反应。研究随访 2 例晚期 NSCLC 患者，患者接受化疗联合免疫治疗（9LA）。分别采集治疗前、治疗后血浆 cfDNA。全部样本标记后进行芯片杂交，使用 InnoScan 1100 扫描。扫描荧光数值用于主成分分析（PCA），对应图 4。
1 号患者治疗无应答。CT 显示肿瘤从 42 mm 增大至 49 mm。InnoScan 扫描获得的甲基化图谱没有明显变化。PCA 图上治疗前后的样本仅见轻微变化，整体甲基化谱无显著改变。
2 号患者治疗有效。PET-CT 显示肺部多处肿瘤病灶大幅消退。InnoScan 扫描的甲基化信号出现明显偏移。PCA 图中样本向健康人群区域移动。
两张影像结果和 InnoScan 读取的甲基化数据趋势总体相关。但这只是初步证据，样本量仅 n = 2，限制普遍性。需要更大的队列进一步验证该检测用于治疗反应监测的可靠性。
六、InnoScan 设备的技术优势与整套检测成本
现有甲基化检测多依赖测序，设备和试剂价格高。本方案使用芯片杂交读取，配合商用 Agilent 24 样本芯片时，单份样本检测成本约 60 美元。完整检测周期 2 至 3 天。InnoScan 设备适配普通杂交芯片，不需要高端测序平台。
InnoScan 读取甲基化区域的总荧光，不单独检测单个 CpG 位点。大片段荧光的整合信号信噪比更高。现有研究证实甲基化以区块形式存在，区块甲基化模式有细胞特异性。这套检测读取模式和生物学特征匹配。InnoScan 可以稳定捕获区块甲基化差异信号。
本研究现在使用通用 CGH 芯片，其覆盖范围有限。研究团队计划开发专用肺癌甲基化芯片。欧洲 LUMEN 临床试验（项目编号 Eu 101188111）正在完善方案。该试验将评估这套检测预测全身治疗反应的能力。
七、研究总结
这篇文献提出一套不用测序的 cfDNA 甲基化肺癌检测方案。整套流程使用 InnoScan 1100 芯片扫描仪采集芯片的荧光信号。扫描仪读取芯片荧光强度，软件依靠扫描数据筛选 170 个肺癌特异性甲基化区域。在 2–4 期肺癌与健康对照的盲测中，样本依靠 InnoScan 数据达到 93.1% 灵敏度、90.3% 特异度，AUC = 0.947。
InnoScan 输出的数据还能完成肺癌亚型区分、治疗效果动态监测的初步探索。整套检测相比测序方案成本更低、流程更简单。它有潜力作为低剂量 CT 筛查的配套分子检测手段。研究的现有局限是受试者仅包含 2–4 期肺癌，对照为健康人群。未来需要扩大早期肺癌、良性肺病的样本量，完成大规模前瞻性临床验证。
文献链接
Agbarya, A., et al., Sequencing-free On-chip detection of lung cancer by fluorescent enzymatic profiling of cfDNA methylation. NPJ Precis Oncol, 2026.
肺癌是全球致死人数最多的恶性肿瘤之一。临床现在多用低剂量 CT（LDCT）做肺癌筛查。LDCT 有明显缺陷：CT 影像会检出大量肺部良性小结节，筛查假阳性率很高。NLST 研究显示初次筛查假阳性率为 26.3%，NELSON 试验假阳性率为 19.8%。这会导致不必要的穿刺或手术。小于 2 cm 的结节很难穿刺取样，肿瘤可能在随访期间进展、转移。此外，LDCT 筛查的依从性目前约为60%。
液体活检可以检测血液里的肿瘤分子信号，能弥补 CT 影像的不足。现有肿瘤液体活检大致分两类。第一类需要手术肿瘤组织提取突变位点，例如 Signatera 肺癌检测对复发和残留病检测敏感，但需要肿瘤组织确定肿瘤特异性突变，无法用于没有原发肿瘤样本的人群。第二类依靠循环游离 DNA（cfDNA）甲基化标志物。甲基化特征在肺癌患者和健康人群中差异明显，是很有前景的生物标志物。但许多现有液体活检对早期或低肿瘤负荷癌症的灵敏度不足。与影像联合，是液体活检更现实的切入点。
当前和新兴的 DNA 甲基化检测依赖 DNA 测序。样本富集和制备、准确分类所需的测序深度以及繁琐的计算分析，使这些检测成本较高。因此，这类检测用于筛查或辅助 LDCT 的成本效益尚不明确。本研究提出一种无需测序的微阵列方法，通过酶促荧光标记 cfDNA 甲基化位点，产生差异甲基化信号模式，从而对血浆 cfDNA 进行低成本、准确、特异的肺癌分类。研究用 103 例受试者样本进行验证，可区分 2–4 期肺癌患者和健康人，灵敏度和特异度均超过 90%。InnoScan 1100 是实验中用于扫描杂交芯片荧光信号的设备。
二、实验流程，对应图 1
1. 提取血浆 cfDNA，连接定制接头。
2. 亚硫酸氢盐处理 DNA。未甲基化 C 会转化为 U，甲基化 CpG 序列保持不变。
3. PCR 扩增处理后的 cfDNA。U 位点扩增后变成 T，原始甲基化 CpG 扩增后仍保留 CG 序列。
4. 突变甲基转移酶 M.Mpel 对 CG 位点连接叠氮基团。
5. 点击化学反应连接荧光基团。只有原始样本中的甲基化位点带有荧光信号。
图 1 cfDNA处理流程流
标记完成的 DNA 样本和芯片探针杂交。杂交完成后，使用 InnoScan 1100 扫描仪采集芯片荧光信号。图 2 展示从临床采血到芯片检测的全流程。
1. 临床采集 4–8 mL 外周血。两步离心分离血浆，提取 cfDNA。
2. 完成酶促荧光标记后，取 500 ng 标记 DNA 和 Agilent 60K Human CGH 芯片杂交。杂交条件为 48°C 温和旋转过夜。
3. 清洗芯片，去除非特异性结合 DNA。把芯片放入 InnoScan 1100 扫描仪扫描。
4. Mapix 软件读取扫描荧光数值，进行背景扣除和荧光定量；随后由自建分析流程完成归一化等分析。
图 2 临床到芯片检测全流程。
芯片上每个探针对应一段基因组区域。探针荧光亮度和原始 cfDNA 在该区域的甲基化水平相关。扫描仪输出完整芯片荧光图片。通过比较肺癌样本、健康对照和差异信号，软件筛选两组信号差异明显的基因组位点。这些位点构成肺癌分类标志物集。
三、InnoScan 扫描数据处理与模型构建
本研究使用 Agilent 60K Human CGH 芯片。芯片覆盖约 6 万个基因组位点，全基因组间隔约 40 kb，在基因体和调控元件区域更密集。InnoScan 1100 扫描得到原始荧光强度数据。研究人员搭建专用数据分析流程，流程分为预处理、标志物筛选和建模三个模块。
第一步是数据预处理。InnoScan 输出的原始信号存在芯片批次和样本间偏差。研究用多项式拟合做归一化处理。超过 99% 的甲基化位点在各组样本中信号稳定。软件以稳定位点或芯片内部校准探针为内参，校准整张芯片亮度。两张芯片校正后样本相似度超过 99%。实验分组时，每张芯片均衡放置肺癌和健康样本。研究在不同芯片和不同时间进行多次实验，以区分真实生物学信号和技术误差。训练集和测试集都不是只来自某一张芯片、某一次实验或某一个批次，而是从所有用过的芯片/批次中都抽取了样本，并且两个集合的样本来源分布尽量一致。第二步筛选差异甲基化标志物。研究设定筛选标准：两组样本甲基化差异大于 20%，统计 p 值小于 0.01。最终筛选出 150–200 个特征，实际用于区分的是 170 个差异基因组区域。建模训练集包含 21 例健康人、22 例肺癌患者。分类规则较简单：待测样本每个标志物的甲基化数值与训练集均值对比。数值靠近健康组记 1 分，靠近肺癌组记 0 分。累加全部标志物分数，用固定阈值区分健康、肺癌人群。
随后，研究使用独立验证集进行盲测。验证集包含 29 例肺癌和 31 例健康 cfDNA 样本，未参与训练。根据甲基化谱，每个样本被赋予分数，分类为健康或肺癌。灵敏度和特异度由盲测结果计算，用于评估诊断准确性。
四、盲测验证核心结果
研究建立独立盲测数据集。数据集包含 29 例肺癌、31 例健康对照。全部芯片经 InnoScan 1100 扫描。扫描数据生成 170 个标志物甲基化热图，对应见图 3a。热图清晰区分健康对照组和肺癌患者组。绿色标记代表早期肺癌样本，黑色标记代表分类错误样本。基于 InnoScan 采集的荧光信号绘制 ROC 曲线，对应图 3b。
图 3a. 标志物甲基化热图； 图 3b. InnoScan 采集的荧光信号绘制 ROC 曲线
在 2–4 期肺癌与健康对照组的盲测中，整套检测方法最优性能指标如下：检测灵敏度 93.1%，特异度 90.3%，曲线下面积 AUC = 0.947。需要注意，本次研究对照仅选用健康人群，真实临床场景需要区分肺癌和良性肺部结节。真实场景特异度可能低于本次数值，或说本次特异度可能高估。但 InnoScan 稳定采集的荧光数据，证明这套无测序检测方法具备进一步开发潜力。
研究额外开展肺癌亚型区分实验。NSCLC 队列包括腺癌 32 例和鳞癌 17 例。将鳞癌特征与 22 例年龄匹配的腺癌患者特征独立比较，筛选出 168 个亚型专属甲基化标志物。这些标志物未包含在癌症/健康分类器中，可区分肺腺癌和肺鳞癌，亚型分类 AUC = 0.881。鳞癌样本正确分类率 86.4%，腺癌样本正确分类率 88.2%。
机制验证方面，研究分析了差异 panel 涉及的基因和生物学通路。由于许多标志物位于基因编码区外，研究使用 GREAT 通过邻近关系或 cis 调控元件功能解释生成相关基因列表。其中包括肺癌中已知的癌基因驱动因子和抑癌基因，如 BRAF、CDKN2B、SMART、RICTOR，以及若干个 EMT/转移调节因子，如 SNAI、Vimentin、ROCK、TRIB、FYN。随后使用 DAVID 进行信号通路富集。严格分析后得到两个高度显著的通路：发育蛋白（UniPort: KW-9996 & KW-0217）和 cAMP 信号通路（UniPort: hsa04024）。发育模块包含 WNT/β-catenin 信号，涉及 TCF7L2 等基因；cAMP 信号相关标志物包括 GNAS 和 VIPR1。
五、InnoScan 数据用于疗效动态监测
初步证据显示，该检测有潜力作为影像的分子补充，监测 NSCLC 患者的治疗反应。研究随访 2 例晚期 NSCLC 患者，患者接受化疗联合免疫治疗（9LA）。分别采集治疗前、治疗后血浆 cfDNA。全部样本标记后进行芯片杂交，使用 InnoScan 1100 扫描。扫描荧光数值用于主成分分析（PCA），对应图 4。
图 4. 疗效动态监测
1 号患者治疗无应答。CT 显示肿瘤从 42 mm 增大至 49 mm。InnoScan 扫描获得的甲基化图谱没有明显变化。PCA 图上治疗前后的样本仅见轻微变化，整体甲基化谱无显著改变。
2 号患者治疗有效。PET-CT 显示肺部多处肿瘤病灶大幅消退。InnoScan 扫描的甲基化信号出现明显偏移。PCA 图中样本向健康人群区域移动。
两张影像结果和 InnoScan 读取的甲基化数据趋势总体相关。但这只是初步证据，样本量仅 n = 2，限制普遍性。需要更大的队列进一步验证该检测用于治疗反应监测的可靠性。
六、InnoScan 设备的技术优势与整套检测成本
现有甲基化检测多依赖测序，设备和试剂价格高。本方案使用芯片杂交读取，配合商用 Agilent 24 样本芯片时，单份样本检测成本约 60 美元。完整检测周期 2 至 3 天。InnoScan 设备适配普通杂交芯片，不需要高端测序平台。
InnoScan 读取甲基化区域的总荧光，不单独检测单个 CpG 位点。大片段荧光的整合信号信噪比更高。现有研究证实甲基化以区块形式存在，区块甲基化模式有细胞特异性。这套检测读取模式和生物学特征匹配。InnoScan 可以稳定捕获区块甲基化差异信号。
本研究现在使用通用 CGH 芯片，其覆盖范围有限。研究团队计划开发专用肺癌甲基化芯片。欧洲 LUMEN 临床试验（项目编号 Eu 101188111）正在完善方案。该试验将评估这套检测预测全身治疗反应的能力。
七、研究总结
这篇文献提出一套不用测序的 cfDNA 甲基化肺癌检测方案。整套流程使用 InnoScan 1100 芯片扫描仪采集芯片的荧光信号。扫描仪读取芯片荧光强度，软件依靠扫描数据筛选 170 个肺癌特异性甲基化区域。在 2–4 期肺癌与健康对照的盲测中，样本依靠 InnoScan 数据达到 93.1% 灵敏度、90.3% 特异度，AUC = 0.947。
InnoScan 输出的数据还能完成肺癌亚型区分、治疗效果动态监测的初步探索。整套检测相比测序方案成本更低、流程更简单。它有潜力作为低剂量 CT 筛查的配套分子检测手段。研究的现有局限是受试者仅包含 2–4 期肺癌，对照为健康人群。未来需要扩大早期肺癌、良性肺病的样本量，完成大规模前瞻性临床验证。
文献链接
Agbarya, A., et al., Sequencing-free On-chip detection of lung cancer by fluorescent enzymatic profiling of cfDNA methylation. NPJ Precis Oncol, 2026.
