Minibox平行生物反应器在mRNA疫苗和药物生产开发上的应用

mRNA作为疫苗，可被广泛应用于传染病、肿瘤以及蛋白替换疗法等领域。
1）传染病领域。mRNA疫苗能够靶定病毒的保守区域，直接在细胞中表达特定抗原，激活机体的免疫应答产生抗体，从而达到预防传染性疾病的目的；
2）抗肿瘤领域。抗肿瘤mRNA疫苗根据作用机理一般分为两类，基于树突状细胞（DC）给药的mRNA疫苗和直接注射的mRNA疫苗；
3）蛋白替代疗法领域。通过将人体变成自身蛋白加工厂，从而治疗一些罕见病。

实际上，早在COVID-19大流行之前，mRNA疫苗就以其独特的优势吸引了大量制药公司参与研发。而如今，mRNA疫苗在新冠领域的成功极大地刺激和推动了mRNA技术的发展和扩张。

迄今为止，mRNA药物生产全过程均较少公开，mRNA原料药生产平台的设计分为2个关键开发领域，上游酶法工艺和下游色谱和超滤纯化；纯化的mRNA被包封成脂质纳米颗粒（LNP）得到最终制剂。mRNA构建体旨在整合许多有助于降低非特异性免疫激活和提高翻译效率的因子。为了降低先天免疫系统的激活，该方法整合了N1-甲基假尿苷修饰核苷；为了提高可翻译性，质粒被设计为编码目标编码序列含5和3'未翻译区域（UTR）和整个Poly（A）尾巴，确保是在人类细胞翻译的最佳尾长。
新冠病毒的抗原为S蛋白，需要设计与构建含有S蛋白基因序列的载体，然后通过大肠杆菌放大培养，获得大量的携带S蛋白基因序列的质粒。
质粒生产是mRNA疫苗生产的重要一步，早在2020年时，为满足这一需求，由迪必尔生物从事十多年原核发酵从研发、中试、大规模商业化生产全过程发酵工作经验的应用支持专家，结合质粒发酵特点，自身实验过程情况，给出质粒开发思路的系统性并具有实验可行性的参考方案，为质粒开发人员撰写IND申报研究方案与研发报告提供参考模板。  

发酵实验简介：质粒小试工艺研发工作需由专业研发人员完成。整个实验过程遵循GLP的基本原则。总体思路，参照中国药典与相关文献，对质粒生产进行小试开发工作，在1.3 L平行反应器中进行培养优化，通过平行反应器筛选，改善产品质量并对每个质粒生产进行工艺参数确认，进而获得可用于中试生产的小试培养工艺。
发酵实验原理：应用大肠杆菌的生长规律与代谢途径，使外源基因质粒在大肠杆菌中扩增。利用质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，随着染色体复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代的规律，对大肠杆菌进行培养，使重组质粒在大肠杆菌中表达。通过平行生物反应器工艺优化来控制微生物的生长速率，来提高质粒分离与结构的稳定性，以提高质粒的表达量。

发酵实验目的：通过1.3 L平行反应器培养，对每个质粒生产进行工艺参数摸索与确认，同时可以获得用于中试放大生产的质粒小试培养工艺。
实验方法与步骤：冻存菌解融后按1:1000比例接种种子液，种子液长好后按照2:100比例移入灭菌好的装有600ml改良LB培养基的反应罐内。初始温度37.0±1.0℃、控制pH 6.9±0.2，溶氧关联搅拌、补料。
 
跳过摇瓶采用1.3 L*8联平行生物反应器培养，通过DOE实验设计，采用指数补料策略，可以实现高密度发酵，增加质粒DNA的稳定性，提高质粒DNA的产量，是摇瓶的50倍以上。取样检测质粒表达水平，每1小时取样测量一次OD600值，记录下时间、温度、pH、转速、溶氧、OD600值，补料流速等数据。OD600值达到20以上每个取样点抽测质粒含量。
通风和搅拌的目的是为了提供菌株生长和代谢所需的氧，大肠杆菌培养在指数生长期对氧的需求量很大，因此及时有效的调节生物反应器通气和搅拌可影响发酵周期的长短和代谢产物生成的高低，足够的溶氧是实现大肠杆菌高密度发酵的关键因素之一。
可靠有效而经济的供氧是极为重要的，控制系统可以改变气体组成中的氧含量，从DO变化情况可以实时了解氧的供需规律及其对生长和产物合成的影响。初始底物消耗完后开始补加甘油溶液/优化复合补料溶液，生长停止结束发酵。 放罐后于4℃环境，4000rpm离心20min，收集离心杯中的菌体，弃上清。进行各发酵数据对比、工艺重现即可完成上游小试工艺确认。

根据1.3L反应器规模工艺优化，对申报确定菌种进行工艺确认，本阶段为一系列实验后的工艺总结，一般使用WCB菌种及阶段报告确定的工艺来完成小试工艺的确定。确定反应器参数以及补料策略等关键控制参数。

质粒DNA的规模化生产通常是在高密度发酵情况下进行的，通过小试规模得到菌种发酵的基本信息和优化条件后，进行规模的放大。对于临床I期的生产，采用了GMP放大方法，典型的I期生物工艺为1.3L至200L，下游处理规模为2L至10L。通过该开发工艺生产的产品，在生产环境中执行GMP并在符合GMP的条件下转入生产时，均符合稳定性测试的验收标准。 2022年4月29日，斯微生物发布公告，宣布其自主研发迭代的新冠病毒mRNA疫苗获得国家药监局批准，将开展临床试验。（https://m.gmw.cn/baijia/2022-05/04/35708026.html）
祝贺迪必尔合作伙伴斯微生物新冠疫苗再次获得我国临床批件！ 大疫三年,新冠病毒不断变异，疫情持续反复，国内mRNA新冠疫苗研发企业们日夜奋战，近期疫情下的上海等城市的生物公司研发人员们平均闭环生产（吃住都在工厂）达50天以上；所面对的困难挑战可想而知，不光生活上的，还有实验开展供应链上的挑战。我们作为链条上的一环，虽然能解决的问题与价值不一样，但目的大家应该是一致的：研发出对抗原始株和变异毒株更有效的新冠疫苗从而终结这场让百姓苦不堪言的疫情！
参考文献：
1.    Whitley,Jill et al. “Development of mRNA manufacturing for vaccines and therapeutics:mRNA platform requirements and development of a scalable production process tosupport early phase clinical trials.” Translational research : the journal oflaboratory and clinical medicine vol. 242 (2022): 38-55.doi:10.1016/j.trsl.2021.11.009