利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法
专题一: 利用Simoa平台开发血浆p217+tau的高灵敏度检测方法
Simoa单分子免疫阵列分析技术是目前市面上最灵敏的蛋白分子检测技术，其可以检测单个蛋白分子，灵敏度达到飞克级别。在肿瘤、神经、感染免疫、心血管、炎症、生殖、眼科等领域都有着广泛应用。Simoa平台是一个开放的研究平台，除现有的商品化试剂盒之外，各领域的研究人员都可自行进行方法开发及分析。
来自美国加利福尼亚和比利时比尔塞的科学家通过自行方法开发对p217+tau进行了研究，并将该检测方法应用于阿尔兹海默症（AD）的临床应用评价。
Development and validation of a high-sensitivity assay for measuring p217+tau in plasma
Alzheimers Dement (Amst). 2021 May 27;13(1): e12204（IF=14.48）
淀粉样蛋白β（A）、微管相关蛋白tau蛋白（T）和神经退行性病变（N）为AD的临床诊断标志。本文利用Simoa平台开发了p217+tau的检测方法，对227名受试者的血浆p217+tau蛋白进行了定量检测，并对其做出临床应用评价。
结果显示：p217+tau血浆检测方法准确、精密、稀释线性好、灵敏度高。所有检测的样本浓度均在线性范围内，AD组的浓度高于健康对照组，血浆和脑脊液水平相关。血浆p217+tau结果可预测中枢T和A状态。
两步法与三步法检测的比较
对96例脑脊液（CSF）标本进行检测，两步法和三步法的检测结果紧密相关（r2 = 0.939）。对10个血清样本进行检测时，在两步分析法中至少有4个样本显示异常高信号，而三步分析法比较稳定。
样品稀释液的选择和优化
使用不同的样品稀释液，用三步法检测四个样品（3个AD患者的血清样品和标准品）的p217+tau浓度。结果可知，含HBR9的Tris稀释液可减少磁珠聚集和假阳性信号。
样本适用性
本研究检测了10名健康对照者和16名轻中度痴呆患者的血清和血浆样本。结果显示，轻度至中度痴呆患者的平均浓度明显高于健康对照组。然而，血浆样本中的p217+tau的浓度约为血清样本的2倍。
检测稳定性
本研究开发的检测血浆217+tau的方法，检测动态范围宽，稀释线性好。5次不同检测的标准曲线信号一致。AD患者血清和血浆样品（n=4）以1:2、1:3、1:4、1:5和1:6的稀释度进行检测，回收率稳定在80%-120%之间，变异系数小于20%。
检测灵敏度和准确性
本方法开发检测血浆p217+tau具有良好的灵敏度和准确度。5个质控样本（1个AD患者血浆pool样、1个AD患者血清pool样和3个标准品缓冲液）分别进行检测，实验结果变异系数低（5%–15% CV）。对227名受试者（157名轻度至中度痴呆和70名认知正常）的血浆样本进行了检测，结果显示，平均组内精确度为7.1%CV（98.2%的样本的CV<20%）。
临床应用
对16名淀粉样蛋白阳性痴呆患者的脑脊液和血浆中的p217+tau分别进行检测，显示中度正相关（r2 =0.43）。对227名受试者（69%的轻度至中度痴呆，31%的认知正常）脑脊液和血浆中的p217+tau进行检测，也证实中度正相关（r2 =0.35）。将样本分为淀粉样蛋白（A）阳性（A+，n=160）或阴性（A-，n=50）受试者，显示脑脊液与血浆相关性仅见于淀粉样蛋白阳性受试者（A+受试者与A-受试者的r2 = 0.27与0.01）。
此外，血浆p217+tau可准确预测中枢淀粉样蛋白阳性和Tau阳性。
总结
血浆p217+tau的检测是一种高度特异、精确、灵敏度高的方法，可以无创地检测中枢淀粉样蛋白和tau状态，有望在不久的将来被纳入AD的临床检测标准中。
