Western印迹法（试剂配制和操作步骤）
Western印迹法（试剂配制和操作步骤）
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。 Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器：高压锅、电动匀浆机、高速离心机、垂直板电泳转移装置、脱色摇床。
试剂：单去污剂裂解液、分离胶、4％浓缩loading、G250考马斯亮蓝溶液、5XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、显影液、定影液、抗体、ECL化学发光试剂。
杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，口罩，保鲜膜，X-光片夹，X-光片，计时器，吸水纸。
试剂配制：
（一）母液
34.8mg/ml (200mmol/L)PMSF
PMSF 0.348g
异丙醇 10ml
溶解后，－20℃保存。
10％SDS
SDS 5g
蒸馏水至 50ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
5mol/LNaF氟化钠
氟化钠 2.1g
超纯水 10ml
溶解后，-20℃保存。
100mmol/L 激活矾酸钠
偏矾酸钠 0.122g
超纯水 8ml
加浓盐酸调节pH至10（颜色变黄），80℃左右热水浴至溶液无色，室温冷却，重调pH至10，重复热水浴和调整pH的操作至溶液保持无色，定容10ml，-20℃保存。
1.0mol/L Tris•HCl（pH8.0）
Tris (MW121.14) 1.212g
超纯水 8ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.0，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为2周。
1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 0.606g
超纯水 8ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至10ml，高温灭菌后室温下保存。
30％Acr/Bic（29：1）
丙稀酰胺（Acr） 14.5g
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 0.5g
超纯水至 50ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
Tween20 10ml
蒸馏水至 50ml
Tween20比较粘稠，需将大枪头前端剪掉，将吸口扩大，吸取和移液时应缓慢，避免液体挂壁，混匀后4℃保存。
（二）使用液
单去污剂裂解液（50mmol/L Tris•HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％SDS，1mmol/L PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）2.5ml
NaCl 0.438g
10%SDS 0.5ml
200mmol/L PMSF 2.5ml
蒸馏水至 50ml
若检测磷酸化蛋白，需加入100ul 5mol/L NaF和500ul 100mmol/L激活矾酸钠，混匀后， 4℃保存。
G250考马斯亮蓝溶液（染胶专用）
考马斯亮蓝G250： 0.063g
甲醇： 15ml
乙酸： 5ml
蒸馏水至 50ml
溶解后，4℃保存。
分离胶（两块胶，10ml）
8％ 10% 12% 15%
超纯水 4.6ml 4.0ml 3.3ml 2.3ml
30％Acr/Bic（29：1） 2.7ml 3.3ml 4.0ml 5.0ml
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml
10％SDS 100ml 100ml 100ml 100ml
10%AP（过硫酸胺） 100ml 100ml 100ml 100ml
TEMED 4ml 4ml 4ml 4ml
加 TEMED后，立即混匀即可灌胶。
4％浓缩胶（两块胶，5ml）
超纯水 2.1ml
30％Acr/Bic（29：1） 0.5ml
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 0.38ml
10％SDS 30ml
10%AP（过硫酸胺） 30ml
TEMED 3ml
加 TEMED后，立即混匀即可灌胶。
还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/L Tris/HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8） 0.5ml
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.078g
SDS 0.1g
10%溴酚蓝 0.05ml
甘油 0.5ml
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
电泳液缓冲液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％ SDS）
Tris（MW121.14） 1.515g
甘氨酸（MW75.07） 9.385g
SDS 0.5g
蒸馏水至 500ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用2～3 次。
转移缓冲液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.01％ SDS，20％甲醇）
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.1g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用2～3次。
10X丽春红染液
丽春红S 0.2g
三氯乙酸 3g
磺基水杨酸 3g
蒸馏水至 10ml
溶解后，避光4℃保存，使用时将其稀释10倍，稀释液勿回收。
TBS缓冲液（10mmol/L Tris/HCl pH7.5, 150mmol/L NaCl）
1 mol/ LTris•HCl（pH7.5） 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
TBST缓冲液（含 0.05％Tween20的TBS缓冲液）
20％Tween20 1ml
TBS 400ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）
脱脂奶粉（国产，安怡牌） 2.5g
TBST 50ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。
洗脱抗体缓冲液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5m mol/L Tris•HCl pH6.8）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇) 700 ml （通风厨里加）
SDS 2g
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8） 12.5ml
超纯水至 100ml
配制时，在通风厨内进行。 4℃保存。可重复使用1次。
ECL化学发光试剂
promage产品，分A和B两种试剂，使用时等体积混合，每张膜使用混合液体积1ml。
