hMAPT人源化小鼠的构建与MAPT靶向分子的体内评价
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的 tau 相关药物研究中有一个现实问题：针对人 MAPT 序列设计的受试分子，往往要在人源化小鼠模型中才能评价其在体作用。tau 蛋白由 MAPT 基因编码，是一种主要表达于神经元的微管相关蛋白，参与微管的组装并维持其稳定。在 AD 中，过度磷酸化的 tau 聚集形成神经原纤维缠结，是该病的病理标志之一，并与疾病进展和认知衰退相关。因此，降低 tau 水平成为该领域受到关注的治疗思路之一，作用于 MAPT 前体 mRNA 的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）已进入临床研究阶段。这类核酸分子依赖与靶序列的碱基互补配对发挥作用，而人源与鼠源 tau 之间存在差异，例如成年人脑同时表达含 3 个和 4 个微管结合重复区的 3R、4R 两类异构体，成年小鼠脑则主要表达 4R 异构体。针对人源序列设计的受试分子，往往难以在普通小鼠体内直接评价其作用。
图1. hMAPT人源化小鼠小脑RT-PCR基因型鉴定
图2. hMAPT人源化小鼠小脑人源MAPT转录本RT-PCR检测
图3. hMAPT人源化小鼠小脑人源MAPT mRNA qPCR检测
图4. hMAPT人源化小鼠七种组织人源MAPT表达qPCR检测
图5. hMAPT人源化小鼠小脑鼠源Mapt mRNA qPCR检测
图6. hMAPT人源化小鼠七种组织鼠源Mapt表达qPCR检测
图7. hMAPT人源化小鼠与野生型脑组织MAPT IHC对比
图8. hMAPT人源化小鼠脑组织人MAPT抗体IHC染色
图9. hMAPT人源化小鼠脑组织人MAPT抗体IF染色
图10. hMAPT人源化小鼠给药后三脑区人源MAPT下调qPCR
构建策略
hMAPT 小鼠通过同源重组，对小鼠内源 Mapt 基因进行了人源化修饰。
表达验证：mRNA 水平小脑组织的逆转录PCR（RT-PCR）检测分别使用鼠源 Mapt 与人源 MAPT 的特异性引物：野生型小鼠仅检出鼠源引物对应的 200 bp 条带，纯合子小鼠仅检出人源引物对应的 181 bp 条带（图1）。
随后，以RT-PCR 扩增小脑中的人源 MAPT mRNA，长度为 2079 bp 的扩增产物仅在纯合子小鼠中检出，野生型小鼠中未检出（图2）。
实时荧光定量PCR（qPCR）给出了一致的结果：使用人源 MAPT 引物检测时，人源 MAPT mRNA 仅在纯合子小鼠小脑中检出，野生型小鼠中未检出（图3）；改用鼠源 Mapt 引物检测时，鼠源 mRNA 仅在野生型小鼠中检出，纯合子小鼠中未检出（图5）。两组检测结合来看，纯合子小鼠小脑中可检出人源转录本，而检测不到鼠源转录本。
qPCR 还覆盖了小肠、胃、肌肉、海马、小脑和皮层共 6种组织：人源MAPT 的相对表达以纯合子小鼠海马水平为参照（图4），鼠源 Mapt 的相对表达以野生型小鼠海马水平为参照（图6），可对照查看该基因在不同组织中的表达分布。
表达验证：蛋白水平
野生型与纯合子小鼠的脑组织MAPT 蛋白检测采用免疫组化（IHC，图7、图8）与免疫荧光（IF，图9）。
功能验证：受试分子体内评价
为考察该品系在药物研究中的适用性，开展了一组给药实验：对10 周龄纯合子小鼠经侧脑室（intracerebroventricular，ICV）注射人工脑脊液（对照组）或AD-1637701，给药后第 14 天取皮层、海马和丘脑组织RNA进行qPCR 检测。结果显示，与对照组相比，AD-1637701 组小鼠上述三个脑区的人源 MAPT mRNA 表达均显著降低（图10）。这组数据表明，该品系可用于在体内检测受试分子对人源 MAPT mRNA 的下调效果。
应用场景
该品系的应用领域为老年痴呆模型。结合上述验证数据，hMAPT 小鼠可用于阿尔茨海默病相关研究中，作用于人源 MAPT mRNA 的受试分子的体内药效评价，例如考察不同脑区中靶 mRNA 的下调程度；也可用于在小鼠体内研究人源 MAPT 的表达与调控。
为什么评价人源MAPT 靶向分子要用人源化小鼠模型？
反义寡核苷酸依赖与靶序列的碱基互补配对发挥作用，针对人MAPT 设计的分子在普通小鼠体内缺少对应靶标。hMAPT 小鼠（目录号 NM-HU-200116）经同源重组人源化修饰后，纯合子小脑中仅检出人源转录本。侧脑室给药后，受试分子可使三个脑区的人源 MAPT mRNA 显著降低（图10）。
关于该品系
hMAPT 小鼠由南模生物研发，目录号 NM-HU-200116。品系的详细信息与完整验证数据，可登录南模生物官网（www.modelorg.com）检索目录号查询，或联系南模生物技术支持获取进一步资料。
关于南模生物
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称“南模生物”），成立于 2000 年 9 月，是上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），专注于模式生物领域，为高校、科研院所及制药企业提供基因修饰动物模型产品与解决方案。咨询电话 400-728-0660。
