双抗细胞株开发策略：单细胞克隆阶段同步筛选滴度与产品质量

双特异性抗体（BsAb）已成为肿瘤免疫治疗领域的重要发展方向，据统计约30%处于晚期临床开发的肿瘤靶向抗体为双抗分子。与单克隆抗体（mAb）相比，BsAb可同时识别两种抗原表位，在增强免疫细胞招募、提高靶向特异性及克服耐药等方面具有显著优势。然而，IgG类BsAb需要组装四条不同的多肽链（两条不同重链及两条不同轻链），其表达过程面临严峻的链配对挑战。

在重组CHO细胞表达过程中，若各条链的表达比例或折叠能力不理想，极易产生半抗体（half-bodies）、同源二聚体（homodimers）及游离轻链等分子杂质。这些杂质不具备双靶点结合活性，且可能引发免疫原性反应，必须在下游纯化中予以清除。更为棘手的是，这些杂质与目标异源二聚体（heterodimer）分子量相近、理化性质相似，常规色谱方法难以实现有效分离，往往需要定制化的精纯方案及高分辨质谱检测，显著增加了工艺开发的时间与成本。

传统细胞系开发（CLD）流程中，产品质量评估通常在fed-batch生物反应器培养及Protein A纯化后才能通过RPLC-MS完成，这意味着大量细胞系需要被推进至资源密集型的生产评价阶段，最终却可能因产品质量不达标而被淘汰。因此，在单细胞克隆阶段建立可预测产品质量的高通量筛选方法，对于缩短双抗开发周期、降低研发成本具有重要价值。

Bruker Beacon® Optofluidic System利用光电定位（OEP）技术将单个CHO细胞分离至OptoSelect®芯片的纳米小室（nanopens）中，通过SpotLight™荧光扩散试剂与抗体保守区结合，可在克隆早期定量检测分泌抗体的滴度。本研究由葛兰素史克（GSK）的团队完成，创新性地将SpotLight™ Huκ与Huλ试剂联合使用，在BsAb单细胞克隆阶段实现了对正确链配对（异源二聚体比例）的预测性评估。

实验结果

01SpotLight™试剂特异性验证

研究团队首先通过预测性结合免疫分析，在10种含不同轻链类型（kappa/lambda）、Fc突变及分子构型的GSK专有mAb和BsAb分子Pannel上验证了试剂特异性。结果显示：SpotLight™ Huκ仅与含kappa轻链的分子结合，Huλ仅与含lambda轻链的分子结合；BsAb分子J（同时含kappa和lambda轻链）在两种试剂中均呈现阳性信号，但荧光强度低于单一轻链亚型的mAb，这与每条轻链仅占总分子一半的结构特征相符。对于Fc区含特定突变（mutation 1）的分子，HuFc试剂结合显著降低，提示在含此类突变的双抗开发中，Fc靶向检测可能受限。

图1. 不同Spotlight试剂和GSK的mAb、BsAb Pannel结合特性评估

将上述细胞系加载至Beacon®平台后，Nanopen水平的AuScore（×1000）检测结果与芯片外的免疫分析完全一致，证实了SpotLight™检测在芯片微环境中的特异性和可靠性。

图2. Beacon NanoPen水平的抗体Pannel结合特性，与芯片外实验结果高度一致。

02双SpotLight™试剂检测揭示转染池异质性

研究以BsAb分子K（含一条kappa轻链臂Arm A、一条lambda轻链臂Arm B，且Fc区含mutation 1）为模型，在Beacon®上同步运行Huκ与Huλ双重检测。结果显示，转染后细胞群体呈现显著的异质性：部分细胞系仅显示Huκ信号（高kappa偏向），部分仅显示Huλ信号（高lambda偏向），另有部分细胞系对两种试剂均呈阳性（无偏向）。同时，仅转染单条质粒的对照细胞系（Arm A Control或Arm B Control）仅在对应轻链检测中显示信号，验证了双检测体系可准确识别单臂表达偏倚。

图3. SpotLight™ Huĸ 和 SpotLight™ Huλ AuScore (x1000) 双重检测NanoPen中表达分子K的细胞亚克隆结果。

为探究偏倚的遗传基础，研究团队对其中46个代表性细胞克隆进行了微滴式数字PCR（ddPCR）基因拷贝数分析。结果表明，SpotLight™结合谱与基因拷贝数高度一致：高lambda偏向细胞系中Arm B轻链基因拷贝数显著高于Arm A；无偏向组则呈现相对平衡的拷贝数分布。值得注意的是，同一质粒上的重链与轻链基因拷贝数呈强相关性（Arm A: R²=0.922；Arm B: R²=0.983），说明质粒整体整合效率决定了各臂的表达潜力。

图4. 表达双特异性抗体分子K及单链对照的导出细胞系（N = 46）的转基因拷贝数分析。

03Fed-batch生产与产品质量验证

将96个按双SpotLight™结合谱分组的细胞克隆（高kappa偏向、部分kappa偏向、无偏向、部分lambda偏向、高lambda偏向及单臂对照）进行Ambr®15 fed-batch培养。收获滴度范围为0.61–7.46 g/L，总AuScore（Huκ + Huλ）与收获滴度呈正相关（R²=0.696），符合Beacon®作为高表达克隆筛选工具的预期。然而，滴度最高的群体为部分lambda偏向组，提示单一轻链高表达并不等同于高质量产品。

图5. 对96个克隆的Ambr® 15 Fed-batch培养工艺参数及代谢物特征分析

经Protein A纯化及RPLC-MS分析后，各组异源二聚体比例呈现显著差异：

• 无偏向组：平均异源二聚体比例为87.26%（±9.33%），杂质谱最干净；
• 部分kappa偏向组：平均84.23%（±8.64%），主要为半抗体A；
• 部分lambda偏向组：平均仅34.34%（±16.71%），半抗体B和同源二聚体B为主要杂质；
• 高kappa/高lambda偏向组及单臂对照组：异源二聚体比例接近0%。

图6. 基于Ambr® 15 Fed-batch培养工艺，SpotLight™检测导出分组的各克隆质量属性分析

研究同时模拟了传统单试剂筛选策略的后果：若仅依据Huκ AuScore选择前25%细胞克隆，平均异源二聚体比例仅为38.9%；若仅依据Huλ筛选，该比例更低至15.9%。这说明在BsAb CLD中，依赖单一SpotLight™检测会系统性地偏向选择高表达、低质量的克隆。

与亲本转染池（异源二聚体85.40%，滴度约3.5 g/L）相比，经双SpotLight™筛选的"无偏向"克隆中，7/8的细胞克隆滴度显著高于亲本池（平均提高1.16 g/L），部分克隆异源二聚体比例较亲本池提升高达17.10%。这证实即使在相对优质的亲本池中，仍存在大量低质量克隆，而双检测策略可有效富集优质细胞克隆。

研究亮点

1单细胞级产品质量预测：在传统CLD仅能评估滴度的阶段，Beacon®通过双SpotLight™组合实现异源二聚体比例的早期预判，将BsAb产品质量评估窗口前移至亚克隆阶段，避免将低质量克隆推进至资源密集型的生物反应器评价。

2与遗传表征高度一致：双SpotLight™结合谱与ddPCR基因拷贝数结果高度吻合，且无需额外培养周期和离线分析，显著缩短决策时间。

3灵活扩展的检测平台：除轻链组合外，SpotLight™ HuFc与轻链试剂的联合使用、或定制荧光抗原/抗体检测，可进一步拓展至含Fc突变双抗、三特异性抗体等更复杂分子的产品质量筛选。

4降本增效的CLD策略：通过在早期排除高偏向、低异源二聚体比例的克隆，可减少进入fed-batch及下游纯化评价的细胞系数量，降低质谱分析负担，加速双抗药物从分子到细胞株的开发进程。

小 结

本研究证实，在Bruker Beacon®平台上联合使用SpotLight™ Huκ与Huλ检测，可在单细胞克隆阶段有效预测含kappa/lambda双轻链BsAb的异源二聚体比例。该方法无需等待fed-batch培养及质谱分析，即可在数千个nanopen中实时识别链表达平衡的优质克隆。基因拷贝数分析与产品质量数据共同支持了双SpotLight™检测的预测准确性，为双抗细胞株早期质量评估提供了可即时部署的解决方案。