Blue Pippin 片段筛选仪在斑马鱼胚胎转座子合子激活研究中的应用

 
研究背景   
转座子（transposable elements，TEs），在斑马鱼基因组中占比高达51%，序列形式多样，部分具备完整转录单元，也有插入到基因中或分布于基因间区域。在早期胚胎发育阶段，转座子可激活表达并发挥关键作用，但关于转座子合子激活（zygotic TE activation，ZTA），即调控胚胎发育与维持基因组稳态的机制尚不清晰。传统短读长 RNAseq 难以区分转座子独立转录本与转座子-基因嵌合转录本，且转座子家族内部序列高度相似，很难完成单拷贝位点精准分析。 

本研究结合长读长测序与人工精准注释，在单一位点、单转录本分辨率下构建胚胎转座子激活全景图谱，解析转座子独特的激活调控规律，挖掘新型功能基因，进一步阐明转座子在早期胚胎发育中的生物学作用。

研究方法   
采集斑马鱼的受精卵至盾胚期共 11 个早期胚胎样本，采用 PacBio IsoSeq 长读长转录组结合 Illumina 短读长测序，开发 aTEA 生物信息分析流程，人工注释区分 TEalone独立转录本、TEgene 嵌合转录本与普通基因，实现转座子单拷贝、单转录本水平分析。利用药物抑制实验、WISH、RNAFISH 探究 ZTA 激活时序与 RNA 亚细胞定位；借助 CRISPRCas9 敲除结合共聚焦成像、qRTPCR 完成新基因功能验证；复用 ATACseq、ChIPseq、小 RNAseq 及小鼠公共组学数据解析 ZTA 表观调控与物种保守性。  
全长转录本长度跨度差异大、长短片段混杂，直接建库测序易出现片段失衡、全长序列缺失的问题，无法精准捕获完整的斑马鱼胚胎全长转座子转录本，降低了全长转录组的注释精度。在全长转录组建库环节引入Sage Science公司Blue Pippin全自动DNA片段筛选系统进行精准分段分选，将扩增后的cDNA产物划分为＜3 kb、＞3 kb 两组，定向富集不同长度全长转录本，分组构建 SMRTbell 文库并在 PacBio Sequel、Sequel II 平台测序。

传统磁珠片段筛选，无法精准定义回收的起点和终点；人工切胶回收，宽范围分选操作难度大、回收率低、易损失长片段。与之相比，Blue Pippin全自动DNA分选仪，精准设置回收片段区间、脉冲场电泳保证大片段DNA分离回收效果，兼具大、小片段DNA的精准分选能力。设备全自动运行，批次稳定性更高、重复性更好，实现长、短全长转录本定向分离富集，有效去除非特异性扩增片段，保障全长转座子转录本完整检出，提升转录结构注释准确度。
 
核心结论   
不同类型转座子在剪接模式、可变剪接能力与自主转座活性方面存在明显差异；转座子合子激活时序滞后，晚于常规合子基因激活，呈现延后爆发激活特点，受Nanog、Mxtx1/2等核心因子协同调控；转座子激活存在高度异质性，主要由表观遗传与基因组环境调控。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-58863-7
Sage Science 公司位于美国马萨诸塞州，2010年成立，专注于核酸领域的样品制备，2万篇文献中应用，包括众多Nature、 Science、 Cell系列的文章，是DNA片段筛选回收领域的行业金标准。
 
* 全自动回收：采用双通道电泳回收专利技术，回收过程全自动运行； 
* 精准回收：精确度高达93-99%，远高于手工切胶和DNA片段分选磁珠的方法
* 微量回收：低起始量，低至ng级，控制时间回收，不直接检测样品
* 高回收率：50-80%的高回收得率
* 省时间：5分钟的手工操作时间，无需额外制胶和切胶
* 全自动完成DNA片段分选，软件中自由选择需要筛选的片段范围，免去了切胶纯化的繁琐步骤，比核酸片段筛选磁珠更加精准可控；
* 用于DNA常规分子生物学，精准彻底地去除PCR引物二聚体、非特异性片段等，去除酶切产物中非目标DNA条带；
* 用于小片段DNA筛选回收（DNA Size Selection），如小RNA/small RNA文库回收、cfDNA／ctDNA循环血游离DNA／循环血肿瘤DNA测序文库、ddRAD-seq双酶切简化基因组测序文库、16S文库微生物测序文库回收等、ChIP-seq文库、MeDIP-seq / hMeDIP-seq甲基化DNA免疫沉淀片段测序文库、ATAC-seq转座酶可及染色质高通量测序文库、遗传病 panel 扩增子文库等各种复杂样本的处理，提高测序数据质量；
* 用于大片段DNA（几kb、几十kb甚至几百kb）精准回收，如PacBio HiFi文库构建、纳米孔测序建库、超长测序（Ultra-Long Sequencing）文库构建等，精准彻底去除小片段DNA，提高测序质量，降低测序成本；
* 低起始量样品的精准浓缩回收：血浆/血清cfDNA/ctDNA，微量细胞/单细胞，空气/冰川/岩石样本，低丰度病原体等；
* 降解样本的精准浓缩回收：FFPE（石蜡切片）、古DNA、腐烂样本、RNA样本等；
* 背景极高的复杂样品的精准筛选回收：废水、土壤、腐殖质、粪便、肠道内容物、痰液、脓液、临床拭子、血液、脑脊液、共生微生物、食品微生物等
 

参数	详情
分离范围	100 bp–基因组DNA
单孔最大上样量	10 μg
电场模式	直流高压 / 低压、脉冲场交变电场
回收模式	窄范围回收、宽范围回收、High Pass大片段回收、Range+T回收
回收方式	自动化回收
准确率	设定值 ±2%（501-600 bp）
重复性	99%（501-600 bp）
大片段准确率	30-40 kb范围＞90%

 
环亚生物：为科研提供 “全链条” 支持
环亚生物科技（APG BIO）作为美国Sage Science公司DNA片段回收系列产品在中国区的独家代理商，为国内二代测序、三代测序用户提供测序样品前处理、质控的整体解决方案：组织研磨仪、单细胞悬液制备仪、细胞破碎仪、超声聚焦打断仪、全自动DNA片段分选回收仪、核酸片段分析仪、脉冲场电泳仪、全自动建库仪、荧光计、超微量分光光度计等。