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一步搞定Th细胞检测中的PMA和离子霉素的刺激浓度
点击次数:3454 发布日期:2015-9-22  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

一步搞定Th细胞检测中的PMA和离子霉素的刺激浓度

1、 按照联科生物 “人Th1&Th2 检测方法”或“小鼠Th1&Th2 检测方法”制备样本;

2、 准备6份样本,按以下浓度加入刺激剂和阻断剂,37 ℃ 5% CO2 培养4~6小时(不要超过6小时),中间混匀几次。

1)PMA 25ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

2)PMA 125ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

3)PMA 250ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

4)PMA 25ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml)

5)PMA 125ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml)

6)PMA 250ng/ml

Ionomysin 1ug/ml

BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml)

 

注:浓度梯度可自由调整,以获得最佳的刺激浓度

3、 将刺激后的血样分别做流式检测

第一管:正常样本未刺激 CD4+胞外CD69

第二管:1)样本 CD4+胞外CD69

第三管:2)样本 CD4+胞外CD69

第四管:3)样本 CD4+胞外CD69

第五管:5)样本 CD4+胞外CD69

以上五管处理方法:

每管加100ul刺激后的细胞,按说明书加入适量的CD4和CD69抗体,室温避光孵育15min。

用2ml预冷PBS洗一次,300g离心5min,弃上清。

用500ul PBS 重悬细胞,上机检测

第六管:4)样本 CD4+胞内CD69

第七管:5)样本 CD4+胞内CD69

第八管:6)样本 CD4+胞内CD69

第九管:2)样本 CD4+胞内CD69

以上四管处理方法:

每管加100ul刺激后的细胞,按说明书加入适量的CD4,室温避光孵育15min。

用2ml预冷PBS洗一次,300g离心5min,弃上清。

涡旋打散沉淀后加入 固定剂 工作液,混匀,4℃避光孵育60分钟。

加2ml破膜剂工作液eBioscience)或PBS(Invitrogen)洗一次,300g离心5min,弃上清

可以重复6-7步一次,最后管内残留液体尽量少,倒出液体后用吸水纸蘸干。

加入破膜剂工作液100ul,同时加入适量的CD69抗体。

离心洗涤细胞并弃去上清液。

重复上一步洗涤细胞。

用500ul PBS重悬细胞,上机检测。

4、结果处理:

不加阻断剂的样本,胞外CD69表达为90%以上

加阻断剂的样本,胞内CD69表达为90%以上,则选择此时的刺激剂浓度作为最佳浓度。

5、Th1/Th2/Th17检测步骤,请参照胞内CD69的染色,即把CD69抗体换成同型对照或者相应的细胞因子抗体即可。

来源:杭州联科生物技术股份有限公司
联系电话:4006721600
E-mail:network@liankebio.com

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