重组小鼠TNF-α三聚体结构与受体活性机制

关键词：重组小鼠TNF-α，三聚体，TNFR1/TNFR2

[导语] 重组小鼠tnf-α蛋白在体外读出的杀伤力，来自一个容易被忽略的前提：三个单体必须先扣在一起。理解了三聚体，才理解为什么解离、稀释、冻融这些操作会直接改掉实验结论。

一、三聚体是怎么扣起来的？

每个 TNF-α 单体是一条 β 三明治，由两条反向平行的 β 折叠片堆成。三个单体沿同一条轴相互咬合，形成漏斗状结构，界面靠疏水堆积与氢键维持，不依赖链内二硫键。

受体结合面落在相邻单体的交界处，也就是说，单独一个单体拿不出完整的结合表位。从分子机制层面分析，这解释了为什么低浓度下活性下降得比预期快——不是分子丢了，而是三聚体解离成了单体。

二、为什么从 Leu80 开始切，可溶型才出现？

TNF-α 先在膜上以 II 型跨膜蛋白的形式存在，胞外段被金属蛋白酶切开后释放出可溶形式。小鼠的切割位点落在 Leu80 附近，切完剩下的 Leu80–Leu235 就是可溶型成熟域。

膜结合型与可溶型并不是同一种分子的两种浓度，它们的受体偏好不同。膜结合型对 TNFR2 的激活更有效，可溶型更容易启动 TNFR1 相关的信号。产品把构建定在 Leu80–Leu235，得到的是可溶型那一份。

三、TNFR1 与 TNFR2，为什么读出完全不同？

TNFR1 在几乎所有细胞上都有表达，胞内段带死亡结构域，通过 TRADD 分别接向 FADD–Caspase-8 的凋亡支路和 TRAF2–NF-κB 的存活支路。两条支路的强弱由细胞状态决定。

TNFR2 主要出现在免疫细胞与内皮细胞上，胞内段没有死亡结构域，靠 TRAF2 与 cIAP1/2 复合物推进 NF-κB 与 JNK，偏向激活、增殖与存活。同一支配体，落到两种受体上，读出方向可能相反。

四、膜结合型与可溶型，差别落在哪？

差别不只是分子量。膜结合型被锚在细胞膜上，两个细胞靠近时才能接触，作用范围局限在局部；可溶型进入体液，能作用到远处的细胞，也更容易被中和抗体捕获。

做体外实验时，这两者的行为不能互推。用可溶型蛋白在培养皿里得到的剂量反应，反映的是全身性信号的强度；局部接触依赖的效应，需要在细胞与细胞共培养体系里才能看到。

五、N 端 6×His 会不会改变它的行为？

His 标签挂在 N 端，远离三聚体界面与受体结合面，通常不影响折叠与装配，也不干扰与受体的结合。它的用处是把蛋白固定到镍芯片或检测板上，或者用抗 His 抗体做检测。

有两个地方需要留意。做封闭或检测时若用了抗 His 抗体，可能把蛋白从体系里抢走，造成假阴性；做 SPR 时若把蛋白固定在芯片上，标签朝向可能影响受体接近的角度，反过来固定受体更接近生理情形。

六、体内实验里，为什么内毒素要先排除？

这支产品的内毒素控制在＜1 EU/μg，用于细胞实验足够，用于动物实验则需要换算：按给药量换算进去的内毒素总量，可能足以单独引起炎症反应，把 TNF 本身的效应掩盖掉。

做法是设一个热灭活对照或内毒素匹配对照。若对照组同样出现反应，说明观察到的表型里混进了内毒素的成分，此时再谈剂量效应，结论就不可靠。

七、结语

三聚体、可溶型、两套受体，这三件事决定了 TNF-α 的读数能从哪个方向解释。把前提想清楚，曲线上的每个拐点才有对应的机制可讲。

八、重组小鼠tnf-α蛋白的产品数据与质控：三张图对应三个层次

重组小鼠tnf-α蛋白的官网数据给了三张图：电泳看蛋白是否完整，细胞毒性曲线看杀伤活性，表面等离子共振传感图看受体结合。三张图分别对应分子、细胞、相互作用三个层次，合起来才够判断一支蛋白能不能用。

图3 SDS-PAGE：M 为分子量标记（10–180 kDa），R 为还原条件、N 为非还原条件，上样量 1 μg，还原条件下主带位于 20 kDa 附近，非还原条件略高（数据来自官网产品页）

图4 细胞毒性曲线：横轴为 TNF-α His Tag, Mouse 浓度（ng/mL，对数刻度），纵轴为细胞存活率百分比，随浓度升高由接近满值下降至基线（数据来自官网产品页）

种属与表达系统 Mouse，大肠杆菌表达
标签与构建区间 N 端 6×His 标签；Leu80–Leu235，即可溶型成熟域
分子量 18.2 kDa
纯度 ＞95%（SDS-PAGE，上样 1 μg）
生物活性 L-929 小鼠纤维肉瘤细胞毒性法，EC50 小于 80 pg/mL
受体结合 表面等离子共振：Protein A 芯片捕获 TNFR-1/CD120a Fc 融合蛋白后与本品结合，亲和常数 0.069 nM
内毒素 ＜1 EU/μg
缓冲体系与保存 20 mM Tris、150 mM NaCl、2 mM TCEP、pH8.0；冻干粉 −20 至 −80℃ 可放 12 个月，复溶后无菌条件 3 个月内用完，避免反复冻融
产品推荐：TNF-α Protein, Mouse（UA040083）

 

优爱（UA BIOSCIENCE）
提供小鼠源 TNF-α 重组蛋白，大肠杆菌表达、N 端 6×His 标签，覆盖 Leu80–Leu235 成熟域，内毒素＜1 EU/μg，L-929 细胞毒性法测定活性，适用于炎症机制研究、受体结合表征与体内模型建立。