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流式细胞术入门原理上机与数据分析全解

浏览次数：27　发布日期：2026-10-26　来源：本站　仅供参考，谢绝转载，否则责任自负

流式那些 FITC、PE、PerCP-Cy5.5、FMO、单阳管……乱乱的？。本期：带你从原理走到上机的流式细胞术入门——回头看，流式细胞术本身并不难。

Section.01
先说清楚：流式到底是什么

一句话：流式细胞术，就是测量"流动中的细胞"与激光相互作用产生的一系列光信号的技术。

细胞被液体裹挟着排成一列，一个个高速通过激光检测点——每秒可以过上万个。每通过一个细胞，仪器就记录一次它的"长相" (散射光) 和"穿的衣服" (荧光) 。于是你得到的是：单细胞水平、多参数同时测量、可以定量的一份数据。分选型流式还能顺手把你要的细胞群挑出来纯化。

顺便澄清一个常见困惑：

很多人以为"流式"只有一种。其实广义的流式是个家族——我们日常说的"流式"多指分选型流式细胞仪 (可用于分析) 和分析型流式细胞仪；此外还有量化成像分析流式细胞仪、质谱流式等，本期就不赘述。

言归正传，传统流式能测什么？只要能制成悬浮液的样本都行：外周血、骨髓、穿刺液、实体组织 (需要处理) 、培养细胞、微生物、藻类、外泌体……颗粒直径在 100 nm – 100 μm 之间都在射程内。

图 1. 流式能"看见"的对象：从抗体、外泌体、病毒，到细胞、染色体，直至变形虫。

硬限制：它只认悬浮样本，贴壁成团的组织，得先打散。

Section.02
仪器怎么工作:
三个系统，各干一件事

流式细胞仪看着吓人，拆开就是三件事：把细胞排队、给细胞打光、把光记下来，对应液路、光路、电路三个系统。

液路：让细胞排成一队

样本悬液本来是"一团浑浊"，怎么让细胞一个一个通过检测点？靠层流和流体力学聚焦。

嗯......小白想要吃透，除了知其然还要知其所以然，咱们今天还是简单讲讲：

液体和气体可按层流或湍流流动：层流 (Laminar flow) 流体平行分层流动，各层不混合，流动路径稳定可预测；湍流 (Turbulence) 流体运动混乱无规律，与层流相反。流式细胞仪液流系统设计必须严格保持层流状态。

图 2. 层流、湍流及管道中的流速。

当液体在流式细胞仪的管道里以层流状态向前流动时，最终会形成抛物线分布：

• 中心最快：管道最中心的液体流速最快，大约是平均速度的 2 倍。
• 边缘最慢：贴近管壁的液体由于摩擦力，流速几乎接近 0。

——这会产生一个反向的压力梯度，即管道中心压力最低，管壁处压力最高 (伯努利原理) 。这种“外高内低”的压力差，会产生一个向内的推力，迫使液体中的细胞或微粒，全部乖乖地自动聚集到流速最快、压强最低的“正中心”。

PS：还记得火车站台上的安全黄线不？就是伯努利原理！流速越快的地方，压强越小。高速列车经过时车身附近空气流速快、压强低，离太近会被外侧高气压推向车轨造成危险。

当然，这还不够。实际操作中，流式细胞仪通过流体力学聚焦 (Hydrodynamic Focusing) 技术，将层流和压力差转化为细胞排成单行的机制，实现过程类似“高管套小管”注射器模型。

图 3. 流体动力学聚焦：细胞被收拢进中心液流，排成单列。

1. 双层套管结构

流动室顶端有两个入口：

外层大管：注入的是鞘流，一般为生理盐水或缓冲液，以恒定高压高流速充满管道，形成稳定层流基底。
内层中心小管：插入外管正中心，注入含细胞悬液的样本流。

2. 借力打力：利用鞘流“夹攻”样本流

样本流从小管推入流动室后，立刻被四周高速流动的鞘流层层包裹，二者同为层流，不会互相混合。鞘流如同无形的“液态约束管道”，从四周对中心样本流施加均匀压力。

3. 锥形收窄，实现“排成单行”

流动室的下半部分设计成锥形结构 (漏斗状) ：

当鞘流和样本流一同流经这个收窄的区域时，根据连续性方程，液流被迫急剧加速。
这时，伯努利原理开始发力：管道中心 (样本流所在位置) 流速变得极快，压强最低；四周 (鞘流) 压强最高。
在这种强大的四周向内的压力差挤压下，原本在样本流里错落分布的细胞，被强行拉伸、变细，最终在管道的正中心被束缚成一条极细的单线(直径通常只有几个到几十微米) 。

新手最容易踩的坑：上样速度！！！

压力越低 (慢流速) ，通道越窄，测量越准。

压力越高 (快流速) ，中心液流越粗，激光聚焦越差，细胞/颗粒重合高，分辨率越低，测量准度下降。

——对于荧光差异较小的测量 (例如细胞周期) ，必须降低样品压力、压低流速。若需缩短采集时间，可通过提高颗粒浓度加快流速。

——利用流式细胞术评估纳米颗粒时，需采用低样品压力与低颗粒密度。因为纳米颗粒尺寸极小，仅靠流体动力聚焦无法避免多个颗粒同时穿过激光斑点，高颗粒浓度下还会引发电子系统饱和。高压与高颗粒浓度会导致纳米颗粒分析产生误差与伪影。

图 4. 增加样品压力 (芯液) 会使细胞路径的最终横截面 (芯液) 扩大，从而导致照明不均匀。

光路：一次"拍照"，两种信息

经过流体动力聚焦后，每个粒子会穿过一个或多个聚焦的光束。那么，细胞或颗粒在流经检测区域时，是如何被激光激发，以及产生的光信号是如何被分流和捕捉的？

可以分为以下四个步骤：

图 5. 典型光路系统：激光 → 透镜 → 二向色镜分光 → 带通滤光片 → 各检测器。

【核心组成部分解析】

1. 激发激光器 (Excitation Lasers)：提供特定波长的单色光来激发细胞上的荧光染料。图中包含三路激光：405 nm (紫光) 、488 nm (蓝光) 和 633 nm (红光)。
2. 透镜和棱镜 (Lenses and Prisms)：用于调整和聚焦激光束，使其精准地对准流动池中的细胞。
3. 流动池 (Flow Cell)：细胞在此处排成单列依次通过，并与聚焦的激光束发生截交。
4. 前向散射光检测器 (FSC - Forward Scatter)：位于激光束正前方的检测器，主要用于测量细胞的大小。
——从激光检测点发出的散射光与发射光由光学透镜收集，随后传输至细胞分选仪的检测器组件。
在此过程中，常用到光学滤光片：可阻挡或反射特定波长的光，同时将有限带宽的光子传输至各检测器。
5. 细胞分选中使用的光学滤光片主要分为以下三类:

"长通" (或称LP)：滤波器允许波长高于截止波长的光通过。如图，二色镜 (Dichroic Mirrors / 长通滤光片 LP)：用于分选不同波长的光。如 640LP：允许大于 640 nm 的光透过，分选出黄色荧光。
"短通" (或称SP)：滤波器允许波长低于截止波长的光通过。
“带通” (Bandpass Filters 或称 BP) ：精确筛选特定波长范围的光进入检测器 (“中心波长/带宽”)，如 530/10：允许 525–535 nm 的绿光通过 (如 FITC/GFP 染料)；585/42：允许 564–606 nm 的黄光通过 (如 PE 染料)。公式：

6. 光电倍增管 (PMT - Photomultiplier Tube)：高灵敏度的检测器，它将过滤后的微弱光信号放大并转化为电信号，最终在电脑上变成我们看到的流式数据图。

大多数细胞仪测量的是两种信息丰富的散射成分：前向散射 (FSC) 和侧向散射(SSC)。

『散射光——细胞的固有参数，不需要染料』

前向散射光 (FSC) 看细胞大小；
侧向散射光 (SSC) 看细胞的颗粒度/复杂度。

FSC-SSC 散点图是每份数据的第一个图，靠它初步分群、去除碎片。

图 6. 血液样本 (外周血白细胞) 的 FSC-SSC 散点图：淋巴细胞、单核细胞、粒细胞各归其位。

『荧光——你"穿在细胞身上"的标签』

荧光技术是瞬时检测的重要工具，目前已有数百种荧光染料可用于流式细胞术分析。

大家在购买荧光染料时，都会看到激发波长 (Eexcitation，Ex) 和发射波长 (Eemission，Em)，发射波长永远大于激发波长，两个波长之间存在差值，被称为“斯托克斯位移”。——当荧光分子具有较大斯托克斯位移时，荧光信号的检测将更为容易。

荧光抗体或核酸染料被激光激发后发光，再由二向色镜和滤光片按波长分给不同的检测器。一个检测器 + 对应激发光 + 前面的光路 = 一个"通道"，有多少荧光通道就能同时测多少参数。

新手最容易踩的坑：死记通道名？？？

——判断染料该进哪个通道，看的是激发光源和滤光片，不是死记通道名！

1. 通道名称是“人为起的代号”，而硬件配置才是“物理事实”：因仪器厂家命名习惯不同，同一物理通道会有不同名称；此外，同一通道可检测多种符合激发波长和发射波长要求的染料。举例：只要染料能被 488nm 激光激发，且发射波长在 530nm 左右 (比如 FITC、GFP、Alexa Fluor 488、CFSE) ，它们进的都是同一个通道。

——核心：两步走

第一步：看激发

购买时染料一般会标注最大激发/吸收波长，波长越接近最大吸收波长，吸收率越高，荧光发射强度越大。——看看仪器上有没有能覆盖到这个波长的激光器 (Laser)，选择与样本荧光染料最匹配的激光线。

注：无需完全匹配，足够接近即可获得最佳激发效果。比如 DAPI，使用 405 nm 激光即可以 4% 的效率激发，从而产生非常明亮的信号。然而，藻红蛋白 (PE) 可被 488 nm 与 561 nm 激光激发，激发效率分别为 40% 与 76%，检测极微弱抗原表达时，用 561 nm 激光激发更适宜，可产生最佳荧光信号。——针对此类情况，可提前查对该荧光染料的激发和发射光谱曲线，以确定合适的激光线。

第二步：看发射

检查染料的最大发射波长，在刚刚选定的那路激光器后面，找哪一个滤光片 (Filter) 的检测范围包裹住了这个波长。

举例：FITC 在 475-610nm 范围内发射荧光，峰值位于 525nm，在一连串检测器里，有一个滤光片写着 530/30 BP (代表通过 515nm–545nm 的光) 。OK，信号就是从这个滤光片后面的 PMT 读出来的。

至于所谓“荧光颜色”，根据可见光波长划分，500–550nm 属于绿色光，所以无论是人类的肉眼还是仪器的检测器，接收到的主导视觉信号都是绿色。因此，“荧光颜色”通常指荧光染料以最高概率发射的光的颜色。

图 7. FITC 的激发与发射光谱。

电路：把光变成数

信号经过放大接着就来到了采集！荧光和散射信号以电脉冲形式采集。

细胞通过检测点产生一个电压脉冲，三个参数：高度 H (Height，峰值强度) 、宽度 W (Width，脉冲宽度/通过时间，反映物理长度) 、面积 A (Area，光子总数，反映真实总量)，正是流式细胞仪 FCS 文件中数据维度的核心来源。

图 8. 电压脉冲三参数：Height (高度) 、Area (面积) 、Width (宽度)。

这组参数有个极重要的用途：去粘连。两个细胞黏在一起时脉冲宽度明显变大，用 FSC-A vs FSC-W (FSC/SSC 的 H、A、W 任一组合) 就能把它们剥出来——这涉及到后面的流式数据分析软件里的圈门工具 (Gate)。不排掉它们，它们会以"双倍荧光强度"混进数据，制造假双阳。

所有流式细胞仪生成的数据文件统称为 FCS 文件 (Flow Cytometry Standard)。数据可以直方图、多种格式的二维图谱、三维图谱及热图等形式进行可视化呈现。

图 9. 流式细胞术中常见的数据分析与可视化方法，涵盖了从传统的单参数/双参数设门 (Gating) 到现代高级的高维降维与聚类分析。

Section.03
上机调设置：阈值和电压

第一步：设置阈值

了解完基础原理，我们来看上机实验的第一步：设置阈值！

流式细胞仪正式数细胞前，需设置“硬性过滤网” (即阈值 Threshold) ，过滤细胞碎片和杂质，不存入数据文件。如果不设置阈值会导致机器被碎片淹没，系统瘫痪死机，或生成大容量废文件。

1. “阈值切得准不准”必须看高度 (H)，不能看面积 (A)

——面积是后来通过“高度×宽度”数学计算出来的 (近似值)。如果在软件里拉出一张以面积 (FSC-A) 为坐标轴的图，你会发现阈值切过的地方边缘是模糊的、软绵绵的 (软边)。

2. 设置阈值时要“顾全大局”

——调机器时，必须把所有组别的样本都拿出来看一眼，尤其要照顾到受刺激最严重 (可能缩得最小) 的样本，去盯着 FSC-H (高度) 通道看，把 Threshold (阈值) 的小红线往左拉，卡在杂质碎片的右边、目标细胞的左边。

3. 检查自己的过滤网 (阈值) 是不是设对地方了，有没有切到自己的细胞“屁股”

——在软件中生成以 FSC-H (高度) 为坐标轴的直方图，FSC-H 图左侧会有一条整齐的“硬边界”，这条边界可确认低于该刻度的杂质已被全部去除。

图 10. 阈值注意事项。

雷打不动：“上机调电压设置”

增益 (Gain) 或电压 (Voltage)，就是你给检测器电路上加的“电量放大倍数”，辨别“信号”与“噪音”。上机跑样时，必须针对每一个通道手动拧旋钮，直到阴性细胞不贴左边墙，阳性细胞不爆右边墙，群落完美落在正中间，让你能看得清、分得开。——它是上机实验时最核心、最需要人工微调的设置。

1. 太高 or 太低？——会影响信号的动态范围和分辨率

电压太低：所有细胞都缩在最左侧的死角里 (贴墙) ，阴性细胞和弱阳性细胞挤成一团，分辨率极差，你根本分不清谁是谁。
电压太高：信号被无限放大，强阳性细胞直接超出了坐标轴的最右侧边界 (爆表)。数据直接变成一条贴在右边墙上的直线，失去了原本的分布特征。

刚刚好的电压：能够让没有发光的阴性细胞规规矩矩地落在左侧 (但没贴墙)，同时让强发光的阳性细胞刚好落在中间偏右。整个图谱拉得很宽、很漂亮，每一个细胞群都清晰可见，这就是最佳的动态范围和高分辨率。

2. 不要偷懒！——每路检测器都要边跑样边调

流式细胞仪里的每一个散射光 (FSC, SSC) 和每一个荧光通道 (FITC, PE, APC...) ，在硬件上都对应一个独立的探测器 (PMT)。

在正式实验开始前，塞进一个阳性对照样本，一边让样本在机器里跑，一边在电脑软件里挨个去拧这十几个通道的 Gain 旋钮。

看着屏幕上的细胞群，手动把 FSC/SSC 调到图中央，把各个荧光通道的阴阳性群拉开到最舒服的位置。

图 11. 利用前向散射 (FSC) 测量演示"增益"或"电压"。

Section.04
荧光补偿：
新手撞上的第一堵墙

为什么会有补偿？

因为荧光染料的发射光谱是有宽度的，通常绵延 100–200 nm，不是一条竖线。FITC 的光除了进自己的主通道 (530/30) ，还会漏进 PE 通道 (575/26) ——在被溢出的通道里造成假阳性。

图 12. 补偿：来自 PE 通道的 FITC (常规单染)。

次要来源还有：某些染料能被不止一个激光激发 (PerCP-Cy5.5 同时被 488 和 405 激发，溢出到 BV711) ；复合染料 (如 PE-Cy7) 在供体通道也有溢出。

补偿调对之后，两群细胞会"横平竖直"地各归其位——这就是手动补偿的原则。在实际的多色实验中，计算这个扣除比例 (比如公式里的 0.15) 不能靠人工瞎猜，须使用单染对照管 (Single-Stained Controls) 让软件自动计算。

Section.05
数据分析：设门和区域

在流式细胞术的数据分析中，设门 (Gating) 和区域 (Regions) 是化繁为简、提取核心结论的“灵魂操作”。

所谓“区域”，简单理解就是一个图纸上的坐标范围 (比如：X 轴 50-100，Y 轴 200-500 的这个方块)。当一个或多个 Regions 被赋予了生物学意义和逻辑条件时，它就变成了“门”。被门圈进去的细胞，会被机器打上标签 (如“活细胞”、“CD4 阳性 T 细胞”)，并作为子群体 (Subset) 进入下一步的嵌套分析。

经典的流式设门“流水线”

在实际拿到数据后，科学家绝对不会上来就看荧光强弱，而是遵循一套雷打不动的“漏斗式”设门策略：

图 13. 获取的数据：未门控与顺序门控对比。

『步骤1. “死活鉴定”门』

操作：在 LD aqua vs FSC-H 图上，用一个多边形门只圈住下方的活细胞 (live cell gate)，把上方死掉的细胞彻底抛弃。

——为什么要抛弃死细胞？ 死细胞的细胞膜漏了，会像海绵一样把抗体非特异性地吸进去，在后面的图里伪装成各种“阳性细胞”。

『步骤2. “去黏连单细胞”门』

操作：把步骤 1 里的活细胞带入下一张图 FSC-A vs FSC-H。用一个狭长的对角线框圈住单细胞 (Singlet gate)，把脱离对角线的黏连事件 (双联体) 过滤掉。

——现在进入下一步的，只有既是活的、又是单个的纯净细胞。

『步骤3. “核心表型”门』

操作：在极度干净的背景下，观察巨噬细胞/髓系细胞的经典标志物 CD11b vs CD11c。此时，右侧那个强阳性的 Cd11b gate (Cd11b+ 门) 边界变得清晰无比，群落之间彻底断开。科学家用一个矩形门将其精准锁定。

『步骤4. “最终靶细胞”分析』

魔法：最后一张图 MerTK vs Ly6G 只展示刚刚被圈进 CD11b+ 门里的细胞。

总之，流式分析就像是剥洋葱。底层第 4 图之所以那么漂亮，是因为它叠加上述的所有逻辑条件：最终展现的细胞 =【活细胞】并且【是单细胞】并且【CD11b 呈阳性】。

——这就是为什么你在看流式文献时，别人图表的上方经常会写一串小字 (如 Gated on Live/Singlets/CD11b+)，它就是在告诉你这层洋葱剥到了第几步。

Section.06
流式：高频应用

三大高频应用

免疫分型：表面抗原 + 胞内因子组合，刻画亚群与功能，OMIP 有现成方案；
细胞凋亡：Annexin V/PI 双染：活细胞 Annexin V⁻/PI⁻、早期凋亡 Annexin V⁺/PI⁻、晚期凋亡与坏死双阳性；
细胞周期：DNA 含量 2N→4N 翻译成各期比例，记得压低流速；

当然，许多检测都可以通过流式细胞术完成，包括但不限于：