PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）和AKT（蛋白激酶B）是细胞内重要的信号分子，它们在细胞生长、存活、代谢和细胞周期调控中发挥着关键作用。PI3K通过催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），进而激活AKT。AKT的激活进一步调控多种下游信号通路，包括mTOR、GSK3β、FOXO等，从而影响细胞的代谢和生长。
一、PI3K-AKT通路的调节机制
PI3K-AKT激活机制始于细胞表面受体（如酪氨酸激酶受体或G PCR）的配体结合，触发PI3K的p85调节亚基募集至质膜，p110催化亚基将PIP2转化为PIP3。PIP3通过结合Akt的PH结构域，促使其膜定位并被PDK1/2磷酸化激活。
二、PI3K-AKT通路的药物研发进展
PI3K-AKT-mTOR通路在乳腺癌、胶质瘤等肿瘤中高频突变。针对AKT的抑制剂开发是近年热点：如Capivasertib（ATP竞争性抑制剂）已获FDA批准，但因其抑制AKT2导致高血糖副作用，临床应用受限。加州大学团队设计出靶向AKT1（E17K突变）的共价抑制剂，通过可逆结合突变位点赖氨酸，显著降低副作用。另外研究发现，PI3K抑制剂与免疫检查点抑制剂（如PD-1单抗）联用，可逆转肿瘤微环境免疫抑制，临床试验显示协同抗肿瘤效应。
此外，该通路在代谢疾病中也有显著作用。PI3K-AKT通路在2型糖尿病胰岛素抵抗（IR）中起核心作用。研究发现，中药复方（如孕育丹糖浆）可通过激活该通路改善IR，其机制涉及增强胰岛素受体底物（IRS）磷酸化及GLUT4膜转运。
三、PI3K-AKT信号通路检测
TR-FRET 均相时间分辨荧光共振能量转移，检测技术灵敏度高，特异性好，重复性好，操作简单，仅需1~4h。一种基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence）的技术，采用夹心法，检测胞内AKT磷酸化水平和总AKT水平。
1. 验证数据
用IGF-1处理MCF7细胞（60000个细胞/孔）与IGF-1在室温下孵育10分钟。数据显示，不同酶标仪对信号的影响。
用LY294002、Wortmannin和S961处理MCF7细胞（60000个/孔），在室温下孵育30分钟，然后用1µM胰岛素刺激细胞，在室温下孵育10分钟。数据显示，LY294002和Wortmannin可以抑制AKT蛋白S473位点的磷酸化，而S961则无抑制效果。
2. 稳定性
TR-FRET Phospho-AKT (308)检测使用NIH3T3细胞（30,000个细胞/孔）在无PDGF-AA和3nM PDGF-AA室温孵育15min分钟。Z值为0.7，表明该检测稳定可靠，适合HTS。
3. QC测试
磷酸化水平实验时，阳性细胞裂解物的titration检测是必要的质量控制（QC）测试，是确保实验结果准确性和可重复性的关键步骤。
TR-FRET Phospho-AKT (308)检测体系常规针对PDGF-AA处理的NIH3T3裂解物进行测试。将NIH3T3细胞在T175培养瓶培养，用3nM PDGF-AA室温孵育15分钟。使用4mL1X裂解缓冲液进行细胞裂解后，裂解物用1X裂解缓冲液连续稀释，三复孔检测。数据显示：裂解物稀释度与TR-FRET比率值之间的线性关系。
图6. Phospho-AKT pan (T308) 质控
参考文献：
1、Hoxhaj G, Manning BD. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 2020 Feb;20(2):74-88. doi: 10.1038/s41568-019-0216-7.
2、Engelman JA. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nat Rev Cancer. 2009 Aug;9(8):550-62. doi: 10.1038/nrc2664.
