光片荧光显微成像技术用于研究牛干细胞15天自组织带血管神经肌肉

关键词：牛胚胎干细胞；共诱导；血管化肌肉

培养肉被视为传统肉类的潜在替代方案，但当前培养牛肉生产普遍依赖成年牛来源的肌卫星细胞与间充质干细胞，其增殖与分化能力在长期培养中受限；牛排类培养肉也常需多种细胞类型分别制备后再行复杂组装。该研究报道了一种基于牛胚胎干细胞的共诱导策略：经体节前中胚层途径，在无血清条件下约15天内同步诱导出骨骼肌纤维、神经元与内皮细胞，并在二维与三维培养中自组织形成组织样结构。肌纤维具备肌节结构与自发钙振荡，可响应共诱导神经元的信号；内皮细胞则在组织内形成均匀的血管网络。这一方案为自组织、含血管与神经支配的牛排式培养肉奠定了基础。

该研究由Marina Sanaki-Matsumiya、Yuya Sanaki、Casandra Villava、Luca Rappez、Nicola Gritti、Fumio Nakaki、James Sharpe、Kristina Haase、Jun Wu与Miki Ebisuya共同完成，论文题为《Self-organization of vascularized muscle from bovine embryonic stem cells》，于2026年9月在线发表于Nature Communications。

重要发现

从牛胚胎干细胞诱导体节前中胚层与肌纤维

骨骼肌在胚胎发育中由体节前中胚层（PSM）经体节、生皮肌节等过渡结构生成，作者据此设计了分步诱导方案。先用CHIR（WNT信号激活剂）、bFGF、SB431542（TGFβ信号抑制剂）与DMH1（BMP信号抑制剂）处理牛胚胎干细胞2天，其间多能性标志物NANOG、OCT4、SOX2表达下降，中胚层标志物BRACHYURY（BRA，即T）与PSM标志物TBX6表达上升，第2天多数细胞呈TBX6阳性，表明PSM诱导高效完成。利用HES7启动子-荧光素酶报告基因实时监测分节时钟，可见清晰的周期性振荡，周期约4小时，与既往报道一致。随后以HGF、IGF、bFGF处理4天，再以HGF、IGF处理9天：成肌细胞标志物MYF5、MYOD1约在第6天上升，肌细胞标志物MYOG、MYF6、MYH7、MYH4约在第10天出现；MYOG与肌节α-肌动蛋白（SAA）双阳性的肌纤维约在第10天首次出现、第14天达峰，平均肌节长度2.1微米，接近体内牛骨骼肌的报道值。整个流程约15天完成，全程无需血清。

牛胚胎干细胞诱导产生前体节中胚层（PSM）与肌纤维

肌肉与神经元的共诱导：早期神经肌肉接头样结构

在共诱导培养中，牛肌细胞与肌纤维表现出自发的细胞内钙水平波动。Fluo-8钙成像显示，各细胞钙振荡的频率与幅度存在差异；加入箭毒（乙酰胆碱受体阻断剂，用于抑制神经肌肉接头）后钙脉冲被显著抑制，提示肌肉与神经元之间已形成早期神经肌肉接头（NMJ）样结构。免疫荧光染色结合共聚焦成像显示，TUJ1阳性的神经元与SAA阳性的肌纤维在第15天相互交织；成熟神经丝标志物SMI-32、NEFM与肌肉标志物MHC、DESMIN呈平行排列。第2天PSM培养物中含SOX2与BRA双阳性的神经中胚层祖细胞，提示诱导出的神经元可能部分源于脊髓神经元。以神经肌肉接头标志物α-银环蛇毒素（α-BTX）染色可见点状信号，多位于肌纤维与神经元紧密相邻处，形态虽未成熟，但符合早期NMJ样结构特征。神经元的刺激可能促进肌肉成熟，有望替代培养肉工程中常用的外部电刺激与机械刺激。

牛肌肉细胞与神经元的共诱导

肌肉与内皮细胞的共诱导：组织内血管网络的形成

血管缺失是制约大尺寸类器官发育的主要瓶颈。鉴于胚胎发育中部分内皮细胞亦源自PSM与体节，作者假设内皮细胞与肌细胞可从同一PSM细胞群共诱导。在牛肌肉诱导方案基础上，自第2天起加入血管生成因子VEGF与毛喉素（forskolin，cAMP信号激活剂），并保留BMP抑制剂DMH1。表达内皮标志物VE-钙黏蛋白（VE-cad，即CDH5）的细长细胞约在第8天出现、第14天达峰，并形成相互连接的血管样网络；VascuMap分析显示，血管段数与分支点数在第8至15天持续增加，网络连通性逐步完善。内皮网络与肌纤维倾向于形成各自独立的小域，第15天时被内皮包绕的骨骼肌域直径约200至300微米，虽超过组织内约100微米的毛细血管间距，但仍处于可比范围。该方案同样共诱导出TUJ1阳性神经元，证实骨骼肌、神经元与内皮细胞可由同一牛PSM细胞群共诱导，并在二维培养中自组织出血管网络。

牛肌肉细胞与内皮细胞的共诱导

三维培养中的组织自组织与单细胞验证

以自组织牛排为目标，作者将方案拓展至三维培养：第2天以2万个PSM细胞制备聚集体，培养基中加入2% Matrigel以维持结构完整性（不加则聚集体散开，浓度过高则发生域分离），第6天后转入75转/分钟的旋转摇床培养，以促进氧气与营养扩散。聚集体呈球形，直径约600微米；经透明化处理后以光片荧光显微镜成像可见，约第10天出现SAA阳性肌纤维，TUJ1阳性神经元在肌肉域旁形成神经域。改变初始细胞数可调节聚集体尺寸：随尺寸增大，骨骼肌与神经域比例逐渐下降；57个聚集体样本的SAA/DAPI染色比值均不低于10%，显示方案可重复性好。单细胞RNA测序进一步验证了肌肉与神经细胞簇，其中内皮细胞簇仅在共诱导方案中出现；肌肉细胞可细分为骨骼肌与平滑肌亚簇，二维方案平滑肌比例更高，而骨骼肌富集的三维方案更适于培养肉应用；神经细胞簇在三维方案中诱导更高效，肌肉与神经细胞簇中还检出神经肌肉接头标志物MUSK与ACHE。

三维培养体系中牛肌纤维的诱导

创新与亮点

该研究在生物成像与组织工程结合层面实现了多项突破。其一，针对三维组织内部结构难以直接观察的难题，采用组织透明化处理结合光片荧光显微镜成像，对直径约600微米的牛肌肉聚集体进行三维成像，可定量肌纤维与血管网络的体积占比。其二，利用Fluo-8活体钙成像证实肌纤维具备功能活性并能响应神经元信号，为培养肉成熟度提供了可量化的光学评价指标。其三，借助HES7启动子-荧光素酶报告基因实现分节时钟振荡的实时监测，并以VascuMap对血管网络连通性进行自动化量化分析。这些光学成像与图像分析手段使肌肉成熟度、血管化程度与神经支配情况可被客观、无损评价，也为类器官及组织工程领域的质控与功能评估提供了可迁移的技术路径。

总结与展望

该研究以牛胚胎干细胞为单一细胞来源，在无血清条件下约15天内实现骨骼肌、神经元与内皮细胞的同步共诱导，并在二维与三维培养中自组织形成含早期神经肌肉接头样结构与血管网络的牛肌肉组织，为牛排式培养肉生产开辟了新路线。未来仍需以多个牛多能干细胞系验证可重复性，以无动物源材料替代Matrigel并降低生产成本，建立内皮网络与可灌注血管系统的连接以促进管腔成熟，并引入基质细胞与施万细胞等辅助细胞类型，推动其商业化应用。

声明：本文仅用作学术目的。 

Sanaki-Matsumiya, M., Sanaki, Y., Villava, C. et al. Self-organization of vascularized muscle from bovine embryonic stem cells. Nat Commun 17, 8975 (2026). 

doi:https://doi.org/10.1038/s41467-026-76569-2