双荧光素标记结合光学成像用于卒中再灌注后微血管阻塞的三维可视化

关键词：微血管阻塞；双荧光素标记；组织透明化

缺血性卒中大血管再通后，组织血流并不总能随之恢复，即"无复流"（no-reflow）。跨皮层与皮层下识别微血管阻塞极具挑战，机制长期不明。研究建立智能三维识别管线：于缺血 / 再灌注前后经尾静脉注射两种荧光素偶联的番茄凝集素，标记全部血管与功能性血管，结合 iDISCO + 组织透明化与光学成像，识别阻塞微血管并考察无复流机制。

该研究由 Yusha Li、Jianyi Xu、Tingting Yu、Jingtan Zhu、Ang Xuan、Xiaomei Liu、Pingfu Wang、Dongyu Li、Dan Zhu 完成，Dan Zhu 为通讯作者。论文 "A labeling strategy for the three-dimensional recognition and analysis of microvascular obstruction in ischemic stroke" 发表于《Theranostics》。

重要发现

01双凝集素标记策略实现阻塞微血管的精准识别

研究采用线栓法建立小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（tMCAo）模型，模拟临床缺血性卒中和机械取栓场景。激光散斑衬比成像显示，阻塞大脑中动脉起始部后皮层血流降至基线的 17%±1%，撤除线栓后恢复至 112%±21%，提示该模型再灌注后微循环恢复并不完全。识别策略的核心是两次不同时相的血管标记：缺血前经尾静脉注射红色荧光素偶联番茄凝集素标记全部血管，处死前 5 分钟注射绿色荧光素偶联番茄凝集素标记功能性血管，仅被红色凝集素标记而未被绿色凝集素标记的微血管即判定为阻塞微血管。研究者还以 anti-Glut1 抗体和 anti-CD31 抗体分别验证两类标记的准确性，确认红色凝集素可标记卒中损伤脑内的全部血管，绿色凝集素可标记功能性血管。

缺血‑再灌注后闭塞微血管的识别

02组织透明化结合光学成像实现微血管三维可视化

为在三维水平分析微血管阻塞，研究比较了CUBIC、PACT、uDISCO、FDISCO 与 iDISCO + 等组织透明化方法，发现溶剂型透明化处理的脑块血管荧光信号强度更高；其中 iDISCO + 处理的脑块几乎无色、形变更小、透光率更高。据此，研究者以 iDISCO + 透明化结合共聚焦显微镜对厚脑块成像，捕获缺血区微血管的三维图像，并在光片显微镜支持下实现小鼠全脑血管成像，使皮层、纹状体等多种脑区的微血管阻塞得以整体观察。

基于组织光学透明技术开展缺血‑再灌注后微血管阻塞的三维分析

03微血管阻塞随时间加重，纹状体重于皮层

三维重建与定量分析显示，缺血再灌注后阻塞微血管的相对体积随再灌注时间延长逐渐增大，阻塞由下游血管逐步扩展至上游血管；对侧脑区微血管则被两种凝集素完整标记。区域比较发现，阻塞微血管主要分布于同侧纹状体，皮层仅少量存在；纹状体功能性血管比例约78%，显著低于皮层的约 99%，提示纹状体微循环再灌注缺损更为严重，可能源于不同脑区细胞组成及细胞间联系的差异。

毛细血管前小动脉与毛细血管内均存在血管阻塞

04毛细血管阻塞与管腔局部狭窄密切相关

为精确定位阻塞点，研究采用anti-αSMA 抗体进行全组织免疫标记以区分小动脉与毛细血管。三维成像显示，上游小动脉阻塞可致下游多个连续微血管血流停滞，而阻塞点不仅存在于 αSMA 标记的小动脉，也存在于无标记的毛细血管，提示再灌注后的毛细血管灌注停滞既有上游小动脉张力升高的因素，也有毛细血管自身的阻塞。高倍成像与管腔直径量化进一步表明，阻塞点处毛细血管管腔出现局部狭窄，且狭窄部位与血管周围细胞爪状核共定位，提示血管周围细胞收缩与毛细血管阻塞相关。

缺血‑再灌注后闭塞毛细血管的微缩现象观察

05中性粒细胞通过加剧管腔狭窄促进再灌注缺损

研究以anti-Ly6G 抗体在造模前耗竭循环中性粒细胞。结果显示，耗竭中性粒细胞后，同侧纹状体阻塞微血管显著减少，脑微循环内中性粒细胞数量随之下降，再灌注缺损得到大幅缓解；生理条件下脑微循环中性粒细胞极少，缺血再灌注后显著增多。对阻塞点与中性粒细胞位置关系的精细分析显示，部分毛细血管被中性粒细胞堵塞且伴随管腔狭窄，但 78 个阻塞点中有 56 个并无中性粒细胞，提示中性粒细胞作为微栓子直接堵塞毛细血管并非主要途径。血管直径量化进一步表明，缺血再灌注后毛细血管管腔收缩，而耗竭中性粒细胞后管腔恢复至正常水平。综上，血管管腔狭窄与中性粒细胞捕获是缺血再灌注后微血管阻塞的关键原因，中性粒细胞主要通过加剧毛细血管管腔狭窄而非微栓子堵塞参与无复流。

缺血‑再灌注后微血管阻塞与中性粒细胞分布的关联

创新与亮点

该研究突破了此前缺乏跨皮层与皮层下区域三维识别阻塞微血管方法的技术瓶颈：活体光学显微镜仅能经颅窗连续监测皮层微循环动态变化，经心染料灌注法既无法准确识别阻塞血管，也难以重建血管网络连接性。该研究首次将"缺血前后两次不同荧光素番茄凝集素标记＋组织透明化＋光学成像" 整合为智能三维识别管线，以不同荧光素凝集素区分全部血管与功能性血管，结合 iDISCO + 透明化实现脑块乃至全脑三维成像，并兼容全组织免疫染色，可同时呈现血管灌注状态与阻塞点细胞来源。该技术在光学生物医疗领域具有明确应用价值：可监测再灌注后微循环缺损的动态演变，为探索无复流机制提供三维证据，可用于评估靶向无复流药物的疗效，并为急性与慢性神经退行性疾病的微循环评估提供可推广的成像手段。

总结与展望

该研究以双荧光素番茄凝集素标记结合组织透明化与光学成像，建立了缺血再灌注后阻塞微血管的三维识别与分析管线，证实微血管阻塞随时间加重，与血管管腔狭窄及中性粒细胞侵入脑微循环密切相关；中性粒细胞并非主要通过微栓子堵塞，而是通过加剧毛细血管管腔狭窄促进无复流。未来可将该策略与活体光学成像互补，监测毛细血管血流，解析血管周围细胞对血流的调控及中性粒细胞加剧管腔狭窄的机制，为改善再通后微循环灌注提供依据。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。 

Li Y, Xu J, Yu T, Zhu J, Xuan A, Liu X, Wang P, Li D, Zhu D. A labeling strategy for the three-dimensional recognition and analysis of microvascular obstruction in ischemic stroke. Theranostics. 2023 Jan 1;13(1):403-416. 

doi:doi: 10.7150/thno.76879.