双AAV载体大基因拆分递送策略研究

关键词：AAV载体；大基因拆分；基因递送

AAV凭借其低免疫原性、高安全性及感染宿主范围广等特点，被广泛应用于各种体内研究，也成为近年来基因治疗领域最重要的一种递送载体之一，但AAV有限的荷载能力（约4.7kb）使其无法递送一些较大的基因，这在一定程度上限制了其应用范围，大基因拆分AAV递送技术的发展解决了这一难题。具体来讲，我们可以将要递送的大片段基因进行拆分，分成两个或三个部分，再由两个或三个独立的AAV载体携带，同时向靶细胞传递后，在细胞内重组整个大基因表达框，表达完整的大蛋白。根据重组机制的不同，可将大片段基因拆分的方法分为：重叠（overlapping）法、反式剪切（trans-splicing）法、混合（hybrid）法。

重叠（overlapping）法

转基因载体A和B包含的CDS序列之间通常拥有400-1400 bp的同源区域，这些重叠区域会发生某种形式的同源重组（HR），从而重建一个大的基因表达框。该策略在载体设计上相对简单，不需要添加其他外源性的功能元件，但十分依赖于目的基因重叠区域本身的同源重组的能力。

（Omar Akil. Hearing Research. 2020）

反式剪切（trans-splicing）法

反式剪切法在两个片段上分别连接了剪接位点的供体序列和受体序列。转基因载体A包含启动子、转基因的5’端以及剪接位点的供体序列；转基因载体B则包含剪接位点的受体序列、转基因的3’端以及polyA信号。当两种病毒转导细胞时，如果A和B形成异源二聚体，则两部分pre-mRNA的剪接将重新组成全长的转基因。

该策略利用的是AAV载体上ITR固有的特性，在ITR的介导下发生分子间重组。ITR介导的分子间重组拼接是一个自发的过程，但是需要克服如串联体形成及拼接有效性等影响拼接效率的问题。拼接效率主要由目的基因分裂位点和选择的剪接信号决定。

（Omar Akil. Hearing Research. 2020）

混合（hybrid）法

混合法结合了反式剪切与重叠两种方法，通过在反式剪切载体上添加高度重叠的外源序列（来自碱性磷酸基因-AP或噬菌体F1基因组-AK）来提高重组效率。转基因载体A包含启动子、转基因5’端、剪接供体序列和同源区域；转基因载体B则包含同源区域、剪接受体序列、转基因3’端及polyA信号。全长基因可通过重叠或反式剪切机制形成。

该策略利用高度重叠的外源序列能指导双AAV载体以正确的方式进行连接，但是剪切信号周围的序列会影响剪切效率，因此需要仔细选择分裂位点来实现大基因片段的有效重组。

（Omar Akil. Hearing Research. 2020）

大基因拆分AAV递送策略案例分享：

常染色体隐性遗传性耳聋 9（DFNB9）是一类具有特殊临床特征的听力损失，主要由编码耳铁蛋白的Otof基因突变引起，Otof基因cDNA编码序列长约6 kb，很难通过单个rAAV递送以实现耳聋基因治疗。Akil O等研究人员利用双AAV载体方法在DFNB9耳聋小鼠模型中成功实现了Otof基因cDNA编码序列的完整表达，实现转导细胞中Otof基因表达的持久恢复和耳聋表型的纠正，而且该治疗不仅在听觉出现前给药预防了Otof-/-小鼠的耳聋，而且在听觉出现后给药还可以持续逆转耳聋表型。

双AAV载体递送后otoferlin在HEK293细胞中的表达

双AAV载体恢复P10 Otof-/-小鼠otoferlin表达并预防耳聋（Akil O, et al. Proc Na