Stain-Free免染Western的技术原理、优势及实验流程

Stain-Free免染Western流程提高了实验速度并能够在实验的每一步进行质量评估：从凝胶电泳到蛋白定量。该流程在电泳几分钟后可视化凝胶蛋白条带，无需额外染色、脱色步骤即可进行总蛋白标准化 (Total Protein Normalization, TPN) 定量，且能够通过总蛋白归一化提高准确性并获得精准定量数据。

Stain-Free技术原理及核心价值
1. 荧光标记：Stain-Free凝胶含有专有的三卤代化合物。在紫外光（UV）激发下，这些化合物会与蛋白质中的色氨酸残基快速发生共价结合，产生荧光信号。
2. 快速成像：电泳后，只需在Stain-Free成像系统（如Bio-Rad ChemiDoc系列成像仪）下进行1分钟的UV激活，即可在凝胶或印迹膜上看到清晰的总蛋白条带，无需传统的考马斯亮蓝或银染等耗时步骤。
3. 过程追踪：由于荧光团与蛋白质共价结合，研究人员可以在电泳后、转膜后等关键步骤随时成像，实时评估蛋白分离和转膜效率，及时发现问题并进行故障排除，避免浪费后续抗体孵育的时间。

总蛋白内参归一化与看家蛋白相比有何优势？
相比传统的看家蛋白（如β-actin、GAPDH），Stain-Free技术采用总蛋白内参（TPN）进行定量分析，具有显著优势。
1. 准确性更高：看家蛋白的表达水平可能会因实验条件、组织类型或样本处理方式而异，导致定量结果不准确。总蛋白归一化则是测量每个泳道的所有蛋白信号总量，更为稳定和可靠。
2. 操作更简化：消除了针对看家蛋白的额外抗体孵育、洗涤以及可能需要的剥离（stripping）和再杂交步骤，大大缩短了实验流程。
3. 线性动态范围广：Stain-Free技术具有较高的检测灵敏度和更宽的线性动态范围，有利于低丰度蛋白的准确定量。
4. 数据更可靠：总蛋白归一化可以更好地控制实验变异性，尤其是在进行磷酸化等翻译后修饰研究时，能提供更可靠的定量数据。

Stain-Free免染Western实验流程

Bio-Rad 的 Stain-Free 免染Western流程提供了实用、方便且可靠的方法来实现总蛋白内参归一化。在凝胶电泳结束后，仅需 1 分钟激发后，就可在凝胶中观察到 Stain-Free 标记的总蛋白信号，并通过成像系统记录总蛋白信号。该技术使研究人员可以轻松地对蛋白质印迹进行总蛋白上样控制。在Western实验结束后，目标蛋白条带也被成像系统记录，软件可自动执行总蛋白的内参归一化定量计算，最终确认各泳道对应目标蛋白的真实表达差异。

Image Lab 软件中使用 Stain-Free 成像仪的总蛋白归一化功能。

为什么 Stain-Free 总蛋白定量优于其他总蛋白染色方法？
传统的总蛋白染色剂（如考染）会阻碍蛋白质印迹的下游转印步骤，操作很不方便，这是阻碍总蛋白定量被广泛应用的障碍之一。Stain-Free 免染技术的独特兼容性使总蛋白成像成为WB定量的更好方法：免染成像后的凝胶可继续进行转印实验、抗体杂交及成像操作，不影响WB后续实验。

Stain-Free 总蛋白在更宽的动态范围内提供定量线性响应：

10–50 μg HeLa 细胞裂解液中三种管家蛋白的免染色总蛋白信号与化学发光信号的线性比较。 (A)免染总蛋白；(B、C、D)β-actin等三种管家蛋白；(E)免染总蛋白、三种管家蛋白的线性比较。尽管actin与tubulin信号呈线性，但光密度远低于实际加载的预测“定量响应”，而免染总蛋白信号与预期结果高度一致。

参考文献：Taylor SC Posch A (2014). The design of a quantitative western blot experiment. Biomed Res Int. 36, 1590