基于Seahorse XF Flex类器官微孔板培养体系的癌症类器官代谢分析

浏览次数：36　发布日期：2026-9-22　来源：安捷伦seahorse

摘要

本文介绍了使用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪和安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官微孔板，通过安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官工作流程对癌症类器官进行代谢分析。使用安捷伦 Seahorse XF 3D 线粒体压力测试试剂盒和线粒体毒性检测试剂盒，通过考察二甲双胍对癌细胞衍生类器官中线粒体功能的影响对工作流程进行了评估。该流程的关键环节包括：优化类器官接种流程、基于图像的归一化，以及使用线粒体毒性指标 (MTI) 对二甲双胍诱导的线粒体功能障碍进行定量评估。该方法能够用于在三维 (3D) 培养模型（如癌症类器官）中筛选和表征靶向线粒体功能的药物。

前言

类器官是临床前研究中的宝贵工具，能够提供更具生理相关性的三维 (3D) 模型，相较于传统的二维 (2D) 培养细胞，能更好地重现原生组织的结构和功能。肿瘤药物筛选通常会先利用 2D 单层培养细胞进行体外效价测试，然后再借助异种移植模型等动物模型进行验证。为了提高临床转化能力，科研人员开发了患者来源的异种移植 (PDX) 模型和人源化小鼠模型。然而，这些模型存在成本高、耗时长、涉及伦理问题等明显局限性。

患者来源的类器官 (PDOs) 被认为是一种极具前景的药物评价和个性化疗法设计替代方案。PDOs 保留了原始肿瘤的关键遗传和表型特征，并能在更具生理相关性的环境中实现高通量筛选。为推动研究模式转型，美国食品药品监督管理局 (FDA) 推出了一项旨在减少对动物试验依赖的路线图，并着重推进新方法 (NAMs) 的开发和验证，其中包括类器官和器官芯片系统。

基于耗氧率 (OCR) 的线粒体呼吸分析是癌症代谢研究的基础技术。安捷伦 Seahorse XF 分析仪已被广泛用于体外评估 OCR 和线粒体功能，尤其是在涉及线粒体靶向药物和线粒体毒性筛查的研究中。安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪能够对多种样本类型（包括类器官和组织样本）的细胞生物能量代谢进行实时测量。具体而言，安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官微孔板针对基质包埋类器官培养进行了优化，可实现长期生长、高分辨率成像和全面的代谢分析。

本应用简报详细介绍了使用 Seahorse XF Flex 类器官工作流程，利用 XF Flex 类器官微孔板评估包埋在 Matrigel 中的HCT116-H2B-GFP (HCT116) 结肠癌细胞衍生类器官的线粒体功能。二甲双胍（1,1-二甲基双胍盐酸盐）是一种成熟的靶向肿瘤代谢的药物，用于抑制线粒体活性。本概念验证研究凸显了基于线粒体毒性指标 (MTI) 的定量方法在评估药物对癌症类器官影响方面的实用性。所述的工作流程未来可以轻松地应用于 PDO 模型。

实验部分

材料与方法

表 1. 安捷伦 Seahorse XF 类器官工作流程中使用的材料和设备

产品	供应商	货号
Seahorse XF Flex 分析仪	安捷伦	S7851A 或 S7851AN
Seahorse XF 类器官 FluxPak		103866-100
Seahorse XF Flex 类器官微孔板		103865-100
Seahorse XF 3D 线粒体压力测试试剂盒		103016-100
Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒		103015-100
Seahorse XF DMEM 检测液包，pH 7.4		103680-100
BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统		_
Matrigel 基质	Corning	356231
HCT116-H2B-GFP CRC 细胞系	_	_
DMEM	Gibco	11995-065
胎牛血清 (FBS)	_	_
Hoechst 33342	Thermo Fisher	62249
二甲双胍（1,1-二甲基双胍盐酸盐）	Sigma	D150959

采用 XF Flex 类器官微孔板进行类器官培养

在补充了 10% 胎牛血清 (FBS) 的高浓度葡萄糖 DMEM 中培养 HCT116-H2B-GFP (HCT116) 细胞。为形成类器官，每孔将 500 至 1000 个细胞包埋进 10 µL 50% Matrigel（约 5 mg/mL蛋白质）中。培养细胞五至七天，使平均直径 ≥ 100 µm。为了防止细胞粘附在 Matrigel 层下，采用了两步接种流程。首先，加入 6 µL 经预冷的 Matrigel，并在 37 ° C 下孵育 20 至 30 分钟。然后，在其上方加入 4 µL 细胞悬液（溶于经预冷的 Matrigel 中），再孵育 20 分钟。最后，每孔加入 250 µL 预热的生长培养基，并每两到三天更换一次。如需了解更多详细信息，请参见安捷伦技术概述^[1]。

Seahorse XF 线粒体压力测试

由于之前的实验已确定寡霉素和鱼藤酮/抗霉素 A (Rot/AA) 的最佳浓度分别为 1.5 µM 和 0.5 µM^[1] ，本研究使用可提供足量化合物试剂的安捷伦 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒。简言之，弃去原有培养基，每孔加入 500 µL 预热的 XF 检测液（基于 Seahorse XF DMEM 培养基配制，pH 7.4，并补充了葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸钠）。然后吸出 450 μL 检测液，再重新补加 450 μL 新鲜预热的检测液，完成一次清洗，接着将微孔板置于无 CO₂ 的培养箱中，在 37 °C 下孵育 45 分钟。试剂盒各组分的加入体积根据 Seahorse XF 细胞线粒体压力测试试剂盒用户手册确定^[2]。

Seahorse XF 线粒体毒性检测

采用 Seahorse XF 线粒体毒性检测评估二甲双胍引起的线粒体功能障碍^[3]。将类器官用不同浓度的二甲双胍处理过夜。实验同时设置溶剂对照组和 Rot/AA 对照组。在检测过程中，寡霉素和 FCCP 的加药浓度采用前述 Seahorse XF 线粒体压力测试中确定的数值（见上一节）。有关此检测的原理和应用的更多详细信息，请参阅安捷伦 Seahorse 线粒体毒性检测白皮书和应用简报^[4,5]。

图像分析和数据归一化

使用配备 4x 物镜的安捷伦 BioTek Cytation 5 进行类器官成像。采集明场和荧光图像（Hoechst 33342 和 GFP），并进行 z 轴叠加。使用 Gen5 软件对目标的总面积（总目标面积）或目标内的总荧光信号强度（总目标强度）进行量化，并用于归一化 OCR 数据。

数据分析

所有数据均上传至安捷伦 Seahorse Analytics 进行分析，并使用 3D 线粒体压力测试和线粒体毒性筛查的助手视图。利用软件中的 Project （项目）功能，合并三次使用相同检测模板和仪器独立完成的实验结果。使用 GraphPad Prism（版本 10.6.1）对 2D 和类器官样本的二甲双胍 MTI 进行了统计对比。

结果与讨论

优化 HCT116 类器官的 XF 线粒体压力测试

采用实验部分详述的两步流程，将 HCT116 细胞以每孔 1000 个细胞的密度进行接种。简言之，将细胞包埋进 Matrigel 中，培养五到六天，在每个孔中形成多个类器官。图 1 显示了接种后第 1 天、第 3 天和第 6 天的类器官 z 轴叠加图像，展现了类器官的不断生长和结构发育。

图 1. 安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官微孔板内，包埋于 Matrigel 中的 HCT116-H2B-GFP 癌症类器官的形成。使用安捷伦 BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统，通过 Gen5 程序（包括在 800 µm 厚度内进行 Z 轴层切图像采集，共采集 5 张图像，然后进行 Z 轴叠加）采集的明场（左）和 GFP 荧光（右）图像。比例尺 = 1000 µm

优化 XF 检测试剂，尤其是羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙 (FCCP)，因为其有效浓度会因类器官类型和来源而异。对于 HCT116 类器官，寡霉素和 Rot/AA 的最佳浓度与 2D 单层培养的 HCT116 细胞所用的浓度一致（数据未显示）。为优化 FCCP，采用了五种 FCCP 浓度（0.25、0.5、1、2 和 4 µM）进行了浓度优化实验。结果表明，1 µM 为诱导最大呼吸的最佳浓度（图 2）。基于上述优化结果，后续实验采用 XF 细胞线粒体压力测试试剂盒代替 XF 3D 线粒体压力测试试剂盒。

图 2. 使用安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官微孔板进行 HCT116 细胞衍生类器官 FCCP 浓度优化实验。将 HCT116 细胞以每孔 1000 个细胞的密度接种/包埋在 11 µL 50% Matrigel 中，然后培养 5 天。A. OCR 动力学曲线图，以明场图像获得的总目标面积进行归一化。B. 由安捷伦 Seahorse Analytics 软件计算得出的最大呼吸

二甲双胍诱导的癌症类器官线粒体功能障碍

为了评估二甲双胍对癌症类器官模型线粒体功能的影响，在第五天用不同浓度的二甲双胍进行过夜处理后进行 XF 细胞线粒体压力测试。如图 3 所示，基础和最大 OCR 均呈剂量依赖性显著降低，表明二甲双胍会损害 HCT116 类器官的线粒体呼吸功能。

图 3. 二甲双胍对 HCT116 癌症类器官线粒体呼吸的影响。将 HCT116-H2B- GFP 细胞在 50% Matrigel 中培养 5 天。在进行安捷伦 Seahorse XF 线粒体压力测试前，将类器官在添加二甲双胍（2.5、5 或 10 mM）的条件下再培养一天。细胞核用 Hoechst 33342 染色，该染料在最后一次加药时（本实验为鱼藤酮/抗霉素 A 混合物）加入。A. OCR 数据随二甲双胍剂量的变化而变化。B. 关键生物能量代谢参数的变化。 C. 使用安捷伦 BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统在检测后采集类器官图像 (4x)，用于数据归一化。OCR 数据通过 Hoechst 33342 的总积分荧光信号强度（总目标强度）进行归一化。比例尺 = 1000 µm

利用线粒体毒性指标对二甲双胍诱导的

线粒体毒性进行定量评估

虽然 XF 细胞线粒体压力测试是一种成熟且广泛使用的线粒体功能评估工具，可提供基础呼吸、 ATP 生成和最大呼吸能力等生物能量代谢参数，但它并非专为快速鉴别化合物对线粒体功能的影响或线粒体毒性而设计。相比之下， XF 线粒体毒性检测提供了一种更直接的读数，用于评估不同培养条件和模型（例如 2D 细胞与 3D 类器官）中的线粒体功能破坏或毒性。通过设置明确的对照条件（溶剂和鱼藤酮/抗霉素 A），该检测能够计算 MTI，这是一个用于比较剂量依赖性线粒体抑制或解偶联的标准化指标。这种靶向分析方法可以实现准确性更高、重现性更好的化合物毒性分析，尤其是在药物筛选和机制研究中^[4,5]。

基于此，本研究采用 XF 线粒体毒性检测来评估二甲双胍对 HCT116 类器官的影响。首先，为了评估检测稳健性和样本适用性，进行了 Z' 因子分析，如图 4 所示。解偶联剂和抑制剂条件下的 Z' 值均超过 0.5，证实该检测适用于筛选 HCT116 类器官模型中药物诱导的线粒体功能障碍。随后测量用浓度递增的二甲双胍过夜预处理的类器官的 MTI 值。使用 Seahorse Analytics 软件准确计算 MTI 需要两个特定的对照组：溶剂组和鱼藤酮/抗霉素 A (R/AA) 组。图 5A 展示了用于检测二甲双胍抑制作用的 XF 线粒体毒性检测板布局，包括不同浓度二甲双胍的四个实验组以及两个对照组。图 5B 显示了三次独立检测的数据。如图所示，二甲双胍的 MTI 值呈剂量依赖性增加。

图 4. 通过 Z' 值评估检测性能。通过 Z' 计算评估了使用 HCT116 类器官的安捷伦 Seahorse XF 线粒体毒性检测的稳健性。A. 用于 Z' 评估的检测板布局。B. Z'评估结果。所有数据均使用根据图像测量的类器官大小（总目标面积）进行归一化，图像使用安捷伦 BioTek Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测系统采集

图 5. 经二甲双胍处理的 HCT116 类器官的安捷伦 Seahorse XF 线粒体毒性检测结果。A. XF 线粒体毒性检测板布局。如图所示，在过夜暴露于四个不同剂量 (n = 4) 的二甲双胍后，测量了二甲双胍抑制剂 MTI。B. 来自三次重复 XF 线粒体毒性检测的代表性数据集。显示的数据来自 Seahorse Analytics 软件，包括抑制剂 MTI 热图、线粒体毒性指标条形图、氧化磷酸化 (OxPhos) 抑制剂响应热图以及内部 Z' 值计算（从左上图顺时针方向）

在该检测条件下，在使用 2D 培养的 HCT116 细胞进行的一组独立的 XF 线粒体毒性检测中（ n = 3），测得二甲双胍 IC₅₀为 2.05 mM（数据未显示）。值得注意的是，在使用 HCT116 类器官时，MTI 在较低浓度 (1.3 mM) 下达到 -0.5，表明类器官可能对二甲双胍的抑制作用表现出更高的敏感性。为了验证这一假设，我们汇总并比较了使用 2D 培养细胞和 3D 类器官进行 XF 线粒体毒性检测获得的 MTI 值。如图 6 所示，双因素 ANOVA 显示，在三个较高的二甲双胍浓度（1.3、2.5 和 5 mM）下，两种培养模型（2D 与类器官）之间的 MTI 值存在统计学显著差异。这些结果表明，类器官模型对二甲双胍的敏感性高于 2D 模型，且该差异呈剂量依赖性。

图 6. 比较二甲双胍对 2D 培养和 3D 类器官 HCT116 细胞的线粒体抑制作用。使用安捷伦 Seahorse XF Pro 和安捷伦 Seahorse XF Flex，分别对经二甲双胍过夜处理的 2D 培养 HCT116 细胞及类器官进行检测，评估二甲双胍的抑制MTI。数据以均值 ± 标准误 (S.E.M.) 表示，结果源自在不同日期进行的三次独立实验，并使用 Seahorse Analytics 软件的 Project（项目）功能计算。使用 GraphPad Prism 软件的双因素 ANOVA 分析差异的显著性

结论

本应用简报介绍了使用基于安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪和安捷伦 Seahorse XF Flex 类器官微孔板的稳健工作流程对癌症类器官进行代谢分析并评估药物对线粒体功能的影响。类器官对二甲双胍表现出更高的敏感性，凸显了 3D 模型在药物筛选和机制研究中的重要性。本方法适用于各种类器官类型，并能为临床前研究中的 NAMs 开发提供支持。

参考文献

1. 利用安捷伦 Seahorse XF Flex 分析仪测量基质包埋类器官的线粒体功能， 安捷伦科技公司技术概述 ，5994-8742ZHCN ，2025
2. Agilent Seahorse XF 3D Mito Stress Test Assay（安捷伦Seahorse XF 3D 线粒体压力测试）， 安捷伦科技公司用户指南 ，5994-8177EN ，2025
3. 安捷伦 Seahorse XF 线粒体毒性测定试剂盒，安捷伦科技公司用户指南 ，5994-3715ZHCN ，2022
4. Rogers, G.W.; Winer, L.; Schwalfenberg, M.; Romero, N.;Kam, Y. 使用安捷伦 Seahorse XF 解决方案开展线粒体毒性评估的原则， 安捷伦科技公司白皮书 ，5994-4732ZHCN，2023
5. Kam, Y.; Rogers, G.W.; Winer, L.; Schwalfenberg, M.;Romero, N. 用于线粒体毒性检测和表征的定制化 XF 工作流程， 安捷伦科技公司应用简报 ，5994-4778ZHCN，2022