单细胞悬液样本制备之Mouse肠道组织解离消化实验流程及步骤
一、实验整体流程
二、取材与组织预处理
操作步骤
1. 将小鼠颈椎脱臼处死之后，用 75% 的酒精对小鼠体表进行消毒，使用手术剪剪开小鼠腹部皮肤并暴露腹腔。
2. 在胃与十二指肠连接处剪开，一边分离小肠周围脂肪组织和肠系膜，一边拉出小肠；之后在小肠和盲肠连接处剪断，分离出完整小肠，将小肠放入装有 10mL 1×PBS（abs962）的培养皿中。 注：处死小鼠后应尽快取出小肠组织，以防小肠离体缺氧时间太长造成细胞活率下降；另外可以使用含有 2% FBS 的预冷 1×PBS 浸泡小肠。
3. 使用眼科剪剪去小肠表面的派氏结，去除表面所有的脂肪和肠系膜残余组织；再用剪刀纵向剪开小肠暴露内容物，并在培养皿中冲洗干净。 注：可以使用预冷的 1×PBS 缓冲液冲洗 2-3 遍小肠组织，以防残留的内容物影响后续解离效果和细胞活率。
4. 随后将小肠分成 2cm 左右的小段，转移至装有 8mL 1×PBS（abs962）的 15mL 离心管中或者培养皿中。
三、机械联合酶消化解离
5. 将上一步获得的小肠组织转移至含有 10mL 洗液 1（abs50093-A）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
6. 取出离心管手动上下颠倒混匀 2min，后将组织取出转移至含有 10mL PBS（abs962）的 15mL 离心管中，再次剧烈上下颠倒混匀 2min。
7. 取出上一步小肠组织转到含有 10mL 洗液 2（abs50093-B）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
8. 取出离心管后上下颠倒混匀 2min，重复步骤 6-7 一次。
9. 取出离心管后上下颠倒混匀 2min，然后将小肠组织转移至含有 5mL 1640 培养基（abs9484）的 15mL 离心管，上下颠倒混匀 30s 以去除上一步残留的洗液 2。
注：在使用洗液 1 和洗液 2 后上下颠倒混匀时，颠倒混匀力度不要太剧烈，以防太过剧烈导致细胞活率降低。
10. 取 100mg 小肠组织，置于装有 2mL 组织解离液（abs50093-C）的 15mL 离心管中，并剪成 0.5cm 左右的小段，在 37°C 培养箱中静置消化 90min。
注：小肠不要剪得太碎，以防过碎导致过度消化、细胞破碎；另外可以在消化过程中每隔半小时上下颠倒混匀离心管。
11. 消化结束后，取出离心管剧烈震荡 3-5min，待组织充分破碎后，将消化液和破碎组织经 70μm 细胞筛过滤，并用 5-10mL 的 1×PBS（abs962）清洗 15mL 离心管后一并过滤收集。
12. 将收集得到的细胞滤液，400×g 室温离心 5min，弃去上清。
13.使用适量的 1×PBS（abs962）重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液可用于后续实验操作。
四、操作演示视频
本实验配套对应操作演示视频，可配合本流程同步参考，规范操作细节。
五、流式质控检测
制备完成的单细胞悬液可通过流式细胞术进行质量控制，验证细胞活率、目标细胞类群比例等关键指标，确保样本质量符合下游实验要求。
六、相关产品
实验所用全套试剂耗材均有对应成品供应，核心试剂货号可参考上述操作步骤中标注内容。
实验所用试剂耗材
产品信息
本文由斯达特技术专家团审核发布
