Brainbow多色报告基因系统原理：Cre-loxP谱系示踪如何实现单细胞标记
单色到多色：为什么需要 Brainbow？
细胞从哪来、到哪去、变成了什么——这大概是发育生物学和再生医学里绕不开的终极追问。谱系示踪技术就是解决这个问题的核心手段：对某类祖细胞亚群进行标记，在后续时间点检测其分化命运，从而揭示多样的基础生物学过程中的分子机制。一直以来，建立能够在体内追踪细胞谱系的遗传修饰动物模型是生物学研究的一个长期目标。
根据重组类型和数量，基因重组系统可以分为传统的单重组酶介导的遗传方法、更复杂的单重组酶介导的多色报告系统方法，以及多重组酶介导的遗传方法。本期鼠博士为大家讲解单重组酶介导的多色报告系统。
单重组酶介导的单色报告基因是最基础的 Cre-loxP 谱系示踪方式，该技术的关键在于评估驱动 Cre 的启动子的表达位置。但单色系统有个明显局限——标记出来的细胞"长得都一样"，无法区分相邻细胞各自的克隆来源。
而 Cre-loxP 系统的多色报告基因可用于单细胞标记和克隆分析，为单细胞增殖、分化后的命运提供了有价值的信息。这种报告系统也被称为"Brainbow"系统。
在 Brainbow 系统中，Cre/lox 重组可在三种或更多荧光蛋白（XFP）之间随机选择表达，从而提供了一种区分相邻神经元和可视化其他细胞相互作用的方法。这类报告基因工具鼠已成为神经科学和发育生物学中不可或缺的研究工具。根据 lox 位点不同，还可以分为 Brainbow-1 与 Brainbow-2。
Brainbow-1：利用不同 lox 变体实现切除式多色标记
基本原理
Brainbow-1 是在报告基因之间加入成对的不同 lox 位点，通过 Cre 介导的切除实现不同的基因重组。
lox 位点的结构： lox 位点是一个 34bp 的序列，由两个 13bp 的反向回文重复序列和 8bp 的中间间隔序列组成：
ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT
N 表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的 Lox 位点。除了野生型 loxP，常见的还有 Lox2272、Lox511、Lox5171 等。在 Cre 酶的作用下，Lox 变体不会与经典 loxP 发生重组，但可以与相同的 Lox 变体发生重组。
利用这一特性，Brainbow-1 通过在同一结构中交替使用变异 lox 位点和经典 loxP 位点，Cre 酶会在任意一对相同的 lox 位点之间进行切除，同时去除另一对位点中的一个，从而防止进一步的重组。这是构建报告基因工具鼠时实现多色随机标记的经典策略。
案例 1（三色切除）
图2. 案例1结构图
当无 Cre 酶表达时：
该系统按照启动子方向，表达红色荧光 RFP。RFP 序列后的 Poly A（pA）介导基因停止表达，后续元件均不表达，因而细胞呈现红色。
当 Cre 酶表达时，出现两种可能：
· 情况一（loxP 切除）： 序列中存在两个同向的 loxP 位点（黑色三角形），Cre 酶切除两个 loxP 位点之间的序列（RFP 被切除）。之后表达黄色荧光 YFP，YFP 后的 pA 介导停止，细胞呈现黄色。
· 情况二（lox2272 切除）： 序列中存在两个同向的 lox2272 位点（斜条纹三角形），Cre 酶切除两个 lox2272 位点之间的序列（RFP 与 YFP 均被切除）。之后表达蓝色荧光 M-CFP，细胞呈现蓝色。
结果：细胞可能存在三种颜色——红色（Cre 未表达）；黄色、蓝色（Cre 表达）。
图3. 案例1结果示意图
图4. 案例2结构图
当无 Cre 酶表达时：
该系统表达橙色荧光 OFP，细胞呈现橙色。
当 Cre 酶表达时，出现三种可能：
· 情况一（loxN 切除）： Cre 酶切除两个同向 loxN 位点之间的序列（OFP 被切除），表达红色荧光 M-RFP，细胞呈现红色。
· 情况二（lox2272 切除）： Cre 酶切除两个同向 lox2272 位点之间的序列（OFP 与 M-RFP 被切除），表达黄色荧光 M-YFP，细胞呈现黄色。
· 情况三（loxP 切除）： Cre 酶切除两个同向 loxP 位点之间的序列（OFP、M-RFP 与 M-YFP 均被切除），表达蓝色荧光 M-CFP，细胞呈现蓝色。
结果：细胞可能存在四种颜色——橙色（Cre 未表达）；红色、黄色、蓝色（Cre 表达）。
基本原理
在 Brainbow-2 中，存在一对或多对方向相反的 loxP 位点，这些反向 loxP 位点分隔多个报告基因的序列。
核心机制： 当两个 loxP 为反向时，Cre 可以倒转中间报告基因的序列，从而产生多个重组结果。只要重组酶存在，倒转就可以持续。通过限制 Cre 酶的活性时间，就可以实现细胞中基因的稳定重组。
案例 1（两色倒转）
当无 Cre 酶表达时：
该系统表达红色荧光 RFP，细胞呈现红色。
当 Cre 酶表达时： 序列中存在一对反向的 loxP 位点（黑色三角形），Cre 可以倒转两个 loxP 位点之间的序列：
· 倒转发生奇数次： 表达蓝色荧光 M-CFP，细胞呈现蓝色。
· 倒转发生偶数次： 表达红色荧光 RFP，细胞呈现红色。
结果：细胞可能存在两种颜色——红色（Cre 未表达）；红色、蓝色（Cre 表达）。
当无 Cre 酶表达时：
该系统表达绿色荧光 nGFP，细胞呈现绿色。
当 Cre 酶表达时，出现四种可能：
a. loxP 位点①与③为同向，Cre 酶切除①与③位点之间的序列（nGFP 与 YFP 被切除），并介导反向 loxP 位点③与④之间进行倒转：
· 倒转奇数次： 表达蓝色荧光 M-CFP，细胞呈现蓝色。
· 倒转偶数次： 表达红色荧光 RFP，细胞呈现红色。
b. loxP 位点②与④为同向，Cre 酶切除②与④位点之间的序列（RFP 与 M-CFP 被切除），并介导反向 loxP 位点①与②之间进行倒转：
· 倒转偶数次： 表达绿色荧光 nGFP，细胞呈现绿色。
· 倒转奇数次： 表达黄色荧光 YFP，细胞呈现黄色。
结果：细胞可能存在四种颜色——绿色（Cre 未表达）；蓝色、红色、绿色、黄色（Cre 表达）。
使用 Brainbow 系统对转基因小鼠特定组织的单细胞进行标记后，即可根据颜色对终点细胞进行分组，从而实现单细胞水平的谱系示踪。这一策略使得研究者可以在同一个遗传修饰动物模型中同时追踪数百个独立克隆的命运，极大提升了谱系分析的分辨率。
Reference：
[1] Livet, J., Weissman, T., Kang, H. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56–62 (2007).
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