ELISA实验的样本收集及稀释处理详述
用于ELISA实验的样本有多种类型，包括血清和血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异。合适的样本预处理，是确保ELISA实验准确性的第一步。下面介绍几种不同样本类型的处理方法：
常规样本处理方式：
血液样本
血液样本分为全血、血浆、血清三种。简单描述：
全血：全血=血浆+血细胞。
血浆：全血加抗凝剂后离心分离出来的淡黄色液体是血浆。
血清：全血不加抗凝剂而自然凝固后分离出来的，不含纤维蛋白原的淡黄色液体是血清。
血液样本是ELISA/液相实验最常用的样本。在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还需要避免细菌污染，因为其可能会导致样本含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。且要避免使用高血脂样本。脂质会影响抗原抗体的结合，从而影响测值的准确性。
1.血清和血浆
血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。
① 使用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或2-8℃过夜，分离出血清；
② 2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，小心收集上层血清。
血浆样本
① 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃条件下，以1000×g离心15分钟，小心收集上层血浆；
② 常见的抗凝剂包括：EDTA钠盐，肝素钠，枸橼酸钠等。
2.细胞培养上清
将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液。
3.细胞裂解液
① 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，再加入适量的培养基，将培养板上的细胞冲洗干净（悬浮细胞可以省略该步骤）；
② 将细胞悬浮液收集到离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心5分钟，再吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；
③ 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂），重悬细胞。添加比例：约1×106个细胞加入150-250μL PBS重悬细胞；
④ 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可使用超声波细胞破碎器，超声处理悬浮液来裂解细胞；
⑤ 2-8℃条件下，以1500×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液。
4.组织匀浆
① 用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织，除去表面残留的血液或杂质；
② 将组织块称重，再切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆；
③ 加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g组织样品对应9mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融；
④ 将匀浆液吸入离心管中，2-8℃条件下，以5000×g离心5分钟，收集上清液。
5.脑脊液
根据实验要求，取适量上清液进行实验测定。
大鼠脑脊液采集方法：采集脑脊液时，用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1.5cm 左右)，在其中点向尾侧沿皮下剪开 2cm，将皮分离两侧，扩大视野。紧贴大鼠头 骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意，有出血时用干纱 布按压止血，保持术口清晰。接近颈后黄韧带时，小心地用 7 号注射针头分离覆 盖的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(针头用止血钳使针尖与针体成 150 度钝 角)，针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液， 一般采集量为 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打开腹腔，另取10mL注射器进行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。
② 在冰面上对肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用无菌管收集肺泡灌洗液后1000xg离心10min，离心后收集上清，并将标本保存于-20℃或-80℃，且应避免反复冻融，如有沉淀形成，应再次离心。
样本保存方法：
样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃的环境中；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测）或-80℃（3个月内检测）的环境中，避免反复冻融。实验前，建议再次离心，去除沉淀物。
注意事项：
1、试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样品中检测物浓度高于标准品的最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议查阅文献，并做预实验）。
2、收集组织与细胞提取液样本时，不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的成分，可能会影响抗原抗体结合，或造成基质干扰，最终影响实验结果。
一个准确的ELISA检测实验，必须包含三大要素：性能可靠的试剂盒、造模成功并准确采集的样本、可控环境且严谨实验操作，三者缺一不可。在操作过程中，经常遇到样本稀释问题，需要进行样本稀释。
一、在ELISA实验过程中，超过试剂盒检测范围的，一般有这几种情况。
样本值高的可能情况:
1、样本中待测物含量过高。一些高丰度蛋白来说，比如免疫球蛋白、脂联素、C肽、载脂蛋白等，在样本中本身含量就很高，有的达到mg/mL浓度。
2、一些受诱导表达的细胞上清中，大量表达，比如小鼠细胞诱导后，大量表达肿瘤坏死因子α（TNFα），小鼠胰岛细胞受诱导后，大量表达胰岛素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表达，比如乙肝表面抗原、C反应蛋白。
4、疫苗原性研究时，注射疫苗的小鼠，会产生大量针对疫苗的抗体。
5、一些被浓缩的样品，比如重组蛋白的产物，单克隆抗体纯品等。
二.如何确定测定样本的稀释倍数呢？样本稀释的原则如下：
在查询背景知识，或者通过预实验，确认了样本浓度过高，需要进行稀释，就要根据以下原则，严谨操作和计算。
1、稀释倍数合理。稀释后样本测定的OD值，要求落在标准品最高值OD值的半量程内，假定标准品最高值的OD值是2.4，那么稀释后的样本，OD值接近1.2，在这个范围附近，计算的浓度值最为准确，以这个结果乘以稀释倍数，得到的样本浓度最准确。
2、稀释过程规范。特别是大倍比的稀释，最好是梯度稀释。比如样本要稀释200倍，就先稀释10倍，再在10倍稀释的基础上，再进行稀释20倍，得到200倍。
3、样本取样量不要太小。在样本充足的情况下，样本取样量不要低于5uL，越低的取样量，在混匀取样过程中，误差越大。
三、在ELISA检测过程中，经常会遇到这样的问题：
样本测定OD值超过标曲最高点OD值，造成测定数据无法直接使用。样本必须进行稀释，如何确定测定样本的稀释倍数？咱们先了解下 样本稀释容易犯的错误有哪些？
1、稀释不足。稀释倍数不足时，容易导致最终结果偏小。
2、过度稀释。过度稀释时，容易导致最终结果偏大。
3、稀释不够规范，引入很多人为偏差。稀释不够规范，特别是大比例稀释时，人为偏差大大增加。
常规样本处理方式：
血液样本
血液样本分为全血、血浆、血清三种。简单描述：
全血：全血=血浆+血细胞。
血浆：全血加抗凝剂后离心分离出来的淡黄色液体是血浆。
血清：全血不加抗凝剂而自然凝固后分离出来的，不含纤维蛋白原的淡黄色液体是血清。
血液样本是ELISA/液相实验最常用的样本。在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还需要避免细菌污染，因为其可能会导致样本含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。且要避免使用高血脂样本。脂质会影响抗原抗体的结合，从而影响测值的准确性。
1.血清和血浆
血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。
① 使用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置1小时或2-8℃过夜，分离出血清；
② 2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，小心收集上层血清。
血浆样本
① 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，2-8℃条件下，以1000×g离心15分钟，小心收集上层血浆；
② 常见的抗凝剂包括：EDTA钠盐，肝素钠，枸橼酸钠等。
2.细胞培养上清
将细胞培养上清液吸入离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液。
3.细胞裂解液
① 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，再加入适量的培养基，将培养板上的细胞冲洗干净（悬浮细胞可以省略该步骤）；
② 将细胞悬浮液收集到离心管中，在2-8℃条件下，以1000×g离心5分钟，再吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次；
③ 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂），重悬细胞。添加比例：约1×106个细胞加入150-250μL PBS重悬细胞；
④ 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可使用超声波细胞破碎器，超声处理悬浮液来裂解细胞；
⑤ 2-8℃条件下，以1500×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液。
4.组织匀浆
① 用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织，除去表面残留的血液或杂质；
② 将组织块称重，再切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆；
③ 加入适量的预冷PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g组织样品对应9mL PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融；
④ 将匀浆液吸入离心管中，2-8℃条件下，以5000×g离心5分钟，收集上清液。
5.脑脊液
根据实验要求，取适量上清液进行实验测定。
大鼠脑脊液采集方法：采集脑脊液时，用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤，剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1.5cm 左右)，在其中点向尾侧沿皮下剪开 2cm，将皮分离两侧，扩大视野。紧贴大鼠头 骨依次逐层剪切各肌层，并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意，有出血时用干纱 布按压止血，保持术口清晰。接近颈后黄韧带时，小心地用 7 号注射针头分离覆 盖的肌肉，暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(针头用止血钳使针尖与针体成 150 度钝 角)，针斜面向上，针尖端近水平刺入蛛网膜下腔，固定针体，缓慢抽取脑脊液， 一般采集量为 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液
① 10%水合氯醛溶液，麻醉腹腔。打开腹腔，另取10mL注射器进行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。
② 在冰面上对肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5mL，分三次灌洗：2mL、1.5mL、1.5mL灌洗，回收率在70%以上。
③ 使用无菌管收集肺泡灌洗液后1000xg离心10min，离心后收集上清，并将标本保存于-20℃或-80℃，且应避免反复冻融，如有沉淀形成，应再次离心。
样本保存方法：
样品收集后，若在1周内进行检测，可保存于2-8℃的环境中；若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测）或-80℃（3个月内检测）的环境中，避免反复冻融。实验前，建议再次离心，去除沉淀物。
注意事项：
1、试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样品中检测物浓度高于标准品的最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释（建议查阅文献，并做预实验）。
2、收集组织与细胞提取液样本时，不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的成分，可能会影响抗原抗体结合，或造成基质干扰，最终影响实验结果。
一个准确的ELISA检测实验，必须包含三大要素：性能可靠的试剂盒、造模成功并准确采集的样本、可控环境且严谨实验操作，三者缺一不可。在操作过程中，经常遇到样本稀释问题，需要进行样本稀释。
一、在ELISA实验过程中，超过试剂盒检测范围的，一般有这几种情况。
样本值高的可能情况:
1、样本中待测物含量过高。一些高丰度蛋白来说，比如免疫球蛋白、脂联素、C肽、载脂蛋白等，在样本中本身含量就很高，有的达到mg/mL浓度。
2、一些受诱导表达的细胞上清中，大量表达，比如小鼠细胞诱导后，大量表达肿瘤坏死因子α（TNFα），小鼠胰岛细胞受诱导后，大量表达胰岛素（INS）。
3、在一些感染性疾病中，大量表达，比如乙肝表面抗原、C反应蛋白。
4、疫苗原性研究时，注射疫苗的小鼠，会产生大量针对疫苗的抗体。
5、一些被浓缩的样品，比如重组蛋白的产物，单克隆抗体纯品等。
二.如何确定测定样本的稀释倍数呢？样本稀释的原则如下：
在查询背景知识，或者通过预实验，确认了样本浓度过高，需要进行稀释，就要根据以下原则，严谨操作和计算。
1、稀释倍数合理。稀释后样本测定的OD值，要求落在标准品最高值OD值的半量程内，假定标准品最高值的OD值是2.4，那么稀释后的样本，OD值接近1.2，在这个范围附近，计算的浓度值最为准确，以这个结果乘以稀释倍数，得到的样本浓度最准确。
2、稀释过程规范。特别是大倍比的稀释，最好是梯度稀释。比如样本要稀释200倍，就先稀释10倍，再在10倍稀释的基础上，再进行稀释20倍，得到200倍。
3、样本取样量不要太小。在样本充足的情况下，样本取样量不要低于5uL，越低的取样量，在混匀取样过程中，误差越大。
三、在ELISA检测过程中，经常会遇到这样的问题：
样本测定OD值超过标曲最高点OD值，造成测定数据无法直接使用。样本必须进行稀释，如何确定测定样本的稀释倍数？咱们先了解下 样本稀释容易犯的错误有哪些？
1、稀释不足。稀释倍数不足时，容易导致最终结果偏小。
2、过度稀释。过度稀释时，容易导致最终结果偏大。
3、稀释不够规范，引入很多人为偏差。稀释不够规范，特别是大比例稀释时，人为偏差大大增加。
