3T3-L1细胞培养及经典成脂诱导“鸡尾酒”过程攻略及步骤

流行性肥胖是近几年的一大健康挑战，肥胖促使一些心血管疾病如高血压、血栓等发病率增高，糖尿病则是以高血糖为特征的代谢性疾病，长期存在可导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。3T3-L1细胞——小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪细胞）系具有向脂肪细胞分化的特性，被广泛用于研究糖尿病，肥胖症等。 

(图一）3T3-L1细胞形态 

（表一） 3T3-L1基础培养信息

培养小提示：
1、 Never allow culture to become completely confluent.！！！细胞汇合度达到70-80%时进行传代。
2、为了避免细胞聚团，在等待细胞消化的过程中，不要通过击打或摇晃瓶子来刺激细胞。难以消化的细胞可以放置在37℃。
3、正常培养（非脂肪诱导期）出现空泡时，请优先考虑环境压力。造成压力的原因包括培养基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌药物、培养基中二氧化碳、碳酸氢钠浓度不当或培养基的营养物质耗尽。
4、使用胎牛血清可能会造成细胞分化！！！  

3T3－L1成脂诱导“鸡尾酒”策略 （图二）3T3-L1细胞（正常）和3T3-L1成脂分化后（对照）
 

一般认为，细胞的增值和分化呈负相关，细胞开启分化必先退出分裂增值周期，常用的方法就是让其生长至融合期，出现接触抑制。脂肪生成是一个将碳水化合物和其他底物转化为脂肪酸，然后作为TAGs（甘油三酯）储存起来的过程。

经典“鸡尾酒”法中，胰岛素样生长因子（IGF-1）激活有丝分裂原蛋白激酶途径诱导细胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制剂（IBMX）通过激活cAMP 依赖性蛋白激酶途径增强 CCAAT/增强子结合蛋白家族 (C/EBPs)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ( PPARγ) 表达促进成脂分化、地塞米松促进C/EBPs的表达。

3T3－L1经典成脂诱导过程

诱导步骤：将融合后的3T3-L1（汇合度100%）细胞从DMEM生长培养基切换到含有0.5 mmol/L IBMX（abs817348）、10 mg/mL胰岛素和1μmol/L地塞米松的分化培养基中48h。然后将细胞维持在含有10%FBS和10 mg/mL胰岛素的DMEM培养基中48h，之后每隔一天更换常规新鲜培养基，一般第九天染色。

PS:不同产品活性纯度不同，浓度仅供参考，不同诱导方案略有差异，IBMX（abs817348）用DMSO溶解时需要超声破碎。

染色：油红O储存液与超纯水按 3:2 稀释混匀，过滤，避光静置后酒红色且无沉淀，现配现用,2h内用完。
用 PBS 磷酸缓冲液小心漂洗细胞三次，以2mL/孔（六孔板）的剂量加入4%多聚甲醛，室温固定40min，再用蒸馏水漂洗2次，每孔加入油红O工作液1mL，常温染色15min，蒸馏水漂洗至无残渣，蒸馏水漂洗后加入PBS镜下观察。

PS:清洗细胞时动摇要轻柔，防止脂滴脱落，油红O工作液一定要过滤至无沉淀，否则染色后有残渣且较难冲洗！！！

“鸡尾酒”诱导策略进击版
有研究者探索了葡萄糖浓度和诱导液2（含10mg/mL胰岛素的低糖培养基）的作用时间对3T3L1细胞成脂分化率的影响，结果显示，低糖培养基诱导时成熟脂肪细胞形成率明显增高，诱导液2作用时间为3d时，成熟脂肪细胞形成率明显高于其他组。 

注：文中图片来源于网络，仅供学习参考用

参考文献
[1]    Ling HY, Wen GB, Feng SD, Tuo QH, Ou HS, Yao CH, Zhu BY, Gao ZP, Zhang L, Liao DF. MicroRNA-375 promotes 3T3-L1 adipocyte differentiation through modulation of extracellular signal-regulated kinase signalling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2011 Apr;38(4):239-46. doi: 10.1111/j.1440-1681.2011.05493.x. PMID: 21291493; PMCID: PMC3086632.
[2]    [1]张轶博,钟悦,曾瑞霞.HAmLET诱导小鼠前脂肪细胞3T3-L1成脂分化[J].锦州医科大学学报,2022,43(04):14-19.DOI:10.13847/j.cnki.lnmu.2022.04.022.
[3]    [1]张晓琴. 优化3T3L1细胞成脂诱导模型并初步探讨miR-222-3p对脂肪生成的作用[D].湖北中医药大学,2020.DOI:10.27134/d.cnki.ghbzc.2020.000193.