高内涵细胞成像分析系统助力人iPSC衍生神经元中线粒体动力学分析

作为动态细胞器的线粒体会经历分裂和融合、在神经元轴突内运动和解体(线粒体自噬)的协调循环，这些动态变化对于能量转换和神经元存活至关重要。因此，了解线粒体动力学的变化非常有助于开发以线粒体为基础的治疗方案以治疗复杂的病变。快速动态活细胞成像与高内涵筛选相结合，是实时大规模定量跟踪这些变化的一种有效方案。本应用展示了如何使用高内涵细胞成像分析系统Operetta@ CLS研究人类iPSC衍生神经元的线粒体动态变化。
 

一，细胞培养

对NeuroSight-S人hiPSC衍生神经元进行解冻、铺板和培养。在包被好的PhenoPlate 384微孔板中每孔接种12000个细胞，培养6天后神经元细胞形成连续生长的轴突网络。

二，化合物准备与细胞染色

用培养基稀释化合物（FCCP、Glutamate）并储存在StorPlate 384 V-bottom微孔板中（每孔75µl）。细胞用10nM PhenoVue 551线粒体染色剂染色20分钟，随后在第一次图像采集前用50µl维持培养基洗涤一次。

三，图像采集设置

使用Operetta CLS进行活细胞成像，共聚焦模式，40x水镜，图像输出binning 3。这种拍摄组合使得PhenoVue 551通道能够以低激发功率和短采集时间成像，这是确保线粒体在受到最小的光毒性/漂白作用下仍然有足够强的信号和良好分辨率的最佳折衷方案。

荧光通道包括PhenoVue 551（PV）和Brightfield（BF），每个通道都可以单独定义帧速以及时间点数量。PV通道以每秒2帧（fps）的速度（每孔）采集50个时间点的图像。BF通道主要用于神经元网络结构识别参考，因此被设置为第二通道组，每孔仅采集一个时间点的图像。

四，化合物处理及成像

在细胞染色之后即对孔板进行第一次成像以建立每孔的初始线粒体动态状态基线。然后细胞用20µM Glutamate、1µM FCCP、2.5µM FCCC或对照培养基进行处理，随后再对细胞进行成像。
 

 

图一. 线粒体动态分数检测工作流程

五，图像分析

使用Harmony®软件分析时间序列图像，以评估随时间变化的动态线粒体分数。为了准确识别线粒体，第一步，用明场图像识别神经元网络区域；第二步，在神经元网络区域中通过PhenoVue 551通道去除细胞体区域，并在剩下的区域中进行线粒体分割。动态线粒体分数则定义为相邻时间点线粒体面积（像素）的差值。最终输出结果为每个时间点的动态线粒体分数与所有线粒体的面积比，这个比值代表了给定时间范围内的线粒体动态（图二）。数据结果表明在整个实验过程中线粒体动态分数是稳定的，证明了图像采集条件的有效性。
 

图二. 用于评估线粒体随时间动态的Harmony软件中的图像分析步骤

进一步对加药组进行图像分析，根据第一次基线测量建立的时间序列面积比平均值计算相对线粒体运动（图三），数据结果表明在5至45分钟的时间内药物作用对线粒体运动的影响都相当稳定，谷氨酸处理未显示线粒体相对运动的显著变化。而经FCCP处理后线粒体的相对运动显著下降。
 

图三. 线粒体动态计算结果

结论：

了解线粒体功能的病理变化对于开发基于线粒体的治疗方案以治疗复杂疾病（如癌症、神经疾病和代谢综合征）至关重要。本应用展示了如何使用Operetta CLS高内涵活细胞成像分析系统研究人iPSC衍生神经元的线粒体动力学。利用PhenoVue 551线粒体染色与低光毒性、高分辨率成像相结合，可以在不损害线粒体功能的情况下在长达1小时的时间内检测线粒体变化，建立高通量成像方法来分析神经元中线粒体的动力学变化。实验结果表明活细胞成像与高通量筛选相结合是实时、大规模分析线粒体动力学的一种有效方案。