南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的高效表达在生物柴油生产中的应用

随着石油资源的日益枯竭和环境保护的需要，生物柴油等可再生清洁能源受到越来越多的关注。



生物柴油，又称脂肪酸甲酯(FAMEs)，通常由非食用油与甲醇酯化或酯交换反应而得。在众多的生产方法中，脂肪酶催化生产生物柴油因其选择性高、反应条件温和、下游加工简单等优点，无疑是最有前景的方法之一。脂肪酶(EC 3.1.1.3，三酰基甘油酯水解酶)可进行催化水解、酯化和酯交换反应，多应用于食品、制药和能源等行业。

来自南极假丝酵母的脂肪酶B (CALB)由于具有多种生物催化用途，是目前研究和应用最广泛的脂肪酶之一。然而，原始CALB的酶活性通常较低，并且从南极假丝酵母中生产CALB的成本也很高，因此，通常需要通过基因工程来异源表达制备重组CALB。

 

南京林业大学的王飞教授团队近期在《Applied Biochemistry and Biotechnology》中发表了相关研究“Efficient Expression of Candida antarctica Lipase B in Pichia pastoris and Its Application in Biodiesel Production”。在此项研究中，科研人员分别进行了7个启动子和5个信号肽在毕赤酵母中表达CALB的密码子优化对比，然后在最佳组合条件下，用高浓度抗生素筛选得到含有3个CALB基因拷贝的重组毕赤酵母。最终使用1.3 L生物反应器(迪必尔生物)，发酵培养约9天后获得的CALB活性和总蛋白含量分别达到444.46±18.81U/mL和5.41±0.1g/L，分别是初始菌株的34倍和20倍。此外，所获得的CALB还用于催化酸化地沟油与甲醇的酯交换反应，这为利用重组CALB作为催化剂将含有大量游离脂肪酸的废弃或低质量生物油原料转化为生物柴油提供了一条很有前景的途径。

 

研究结果可为酵母中CALB的高效表达和提高脂肪酶产量提供参考，同时也为其他有价值蛋白质的生物生产带来新的可能性。

 

主要研究路线

#1   CALB表达质粒及重组菌株的构建及筛选

研究人员从南极假丝酵母中克隆扩增出WT-CALB基因，并以pPICZαA为载体构建出pPICZαA-WT-CALB，同时选择两个突变位点(V210I/A281E)进行密码子优化。将优化后的基因插入pPICZαA的EcoR I和Kpn I酶切位点之间，主要有诱导启动子P_AOX1，组成启动子P_GCW14, the P_PDC, P_PYK, P_P9，甲醇诱导启动子P_FLD1，P_AOX1d1+201七种启动子。同时，人工合成4种信号肽mα, MFΔ, SP23, pre-Ost1-pro-αMF来调控CALB的表达合成。

 

对重组质粒进行线性化处理，并通过电转的方式转入感受态毕赤酵母中。随后在30℃条件下孵育1-2小时，转移至筛选培养基上培养3-4天，最终鉴定筛选出所需的重组菌株进行下一步的摇瓶实验。

#2   工程菌株在摇瓶上进行相应培养

将携带有CALB基因的阳性工程菌株接种于含有2mL YPD培养基的20mL摇管中，30℃，250rpm条件下培养过夜，随后更换培养基为BMGY。为了在组成型启动子（P_GCW14, the P_PDC, P_PYK, P_P9）的调控下表达CALB，以初始OD₆₀₀值为1.0的密度将毕赤酵母接种于250mL的摇瓶中。为了在甲醇诱导启动子（P_FLD1，P_AOX1d1+201）下表达CALB，将酵母细胞接种于含有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，生长约12-16 h后离心，重悬于含有50mL BMMY培养基的250mL摇瓶中，初始OD₆₀₀值为1.0。每24 h向BMMY培养基中加入0.5% (v/v)甲醇。每24 h收获1毫升培养物，进行蛋白质浓度和酶活性测定。

 

如图1所示，P_GCW14相对于P_AOX1表现出更强的启动子能力，选择P_GCW14后，CALB的活性增加约29%，蛋白浓度增加至0.27±0.01 g/L。如图2所示，所有信号肽的分泌能力均高于αMF信号肽。其中，Mα信号肽的活性最高，可使CALB活性提高46%。SP23、MFΔ和pre-Ost1-pro-αMF信号肽分别使CALB活性升高约41%、29%和35%。此外，Bradford法显示，各信号肽下CALB蛋白浓度均升高，其中Mα信号肽使CALB表达量升高至0.36±0.02 g/L。
 

图1. 不同启动子控制下表达的脂肪酶活性比较。不同字母表示差异显著(p<0.05)。

图2. 不同信号肽控制转化代表的脂肪酶活性比较。不同字母表示差异显著(p<0.05)

 

同时研究人员考虑了不同基因拷贝数对于CALB表达分泌的影响，使用含有高浓度博来霉素的YPFS板来筛选具有多重整合的菌株，最终获得了几个多拷贝克隆，最大拷贝数为4。表1显示CALB的活性随着基因剂量的增加而增加。然而，四拷贝菌株的活性不如三拷贝菌株。这表明基因剂量存在平台效应。三拷贝菌株的CALB活性约为28.69±0.99 U/mL，比原菌株的CALB活性提高约124%。然而，分泌CALB的产生似乎并不随着基因剂量的增加而增加。多拷贝菌株与低拷贝菌株的分泌蛋白产量无显著差异。研究人员表示这是可能的，过量的蛋白质造成细胞负荷，导致蛋白质沉积在细胞中。然而，CALB基因的引入似乎对宿主的生长没有任何影响，这需要进一步分析。
 

表1. CALB不同拷贝数重组菌株脂肪酶表达情况比较

 

#3   重组菌株在生物反应器上进行培养

所有补料分批发酵均在生物反应器(迪必尔生物）中进行，该反应器可控制4个发酵罐同时运行。科研人员选择上面提到的CALB三拷贝重组菌株作为工作菌株，以10% (v/v)接种量接种于含有0.6 L培养基的1.3 L发酵罐中。初始温度设定为30℃，当酵母细胞OD₆₀₀达到200左右时，将温度调整到20℃。pH值设置为5.5，通过加入25% (v/v)的氢氧化铵或30% (v/v)的H₃PO₄调节pH值。在整个发酵过程中，通过控制搅拌和通气，将DO控制在20-30%左右。以DO突然升高作为甘油耗尽的表现，补加500 g/L (w/v)甘油，并添加1.2% (v/v) PTM1。每12 h收集发酵液，分析OD₆₀₀、总蛋白含量和脂肪酶活性。

 

图3为重组菌株在BSM培养基中的发酵情况。在10天的发酵过程中，OD₆₀₀值最高可达1600，干细胞重超过400 g/L，真正实现了高密度发酵。培养约9 d后，CALB活性和蛋白质含量最高，分别达到438.16±2.41 U/mL和4.05±0.1 g/L。酶活性和蛋白质含量分别比处理前提高了34.23倍和20.25倍。考虑到生物反应器中菌株死亡导致发酵液中残留蛋白的存在，CALB的比活性可能会进一步增强。此外，在相同条件下，科研人员将所得的CALB与市售CALB进行了比较。结果表明，脂酶CALB的活性约为380 U/mL，表明发酵罐中产生的CALB活性与市售酶相当。
 

图3. CALB重组菌株在BSM培养基中的发酵图谱

 

图4为重组菌株在FM22培养基中的发酵情况。发酵过程与BSM培养基基本相同，酶活性最高为444.46±18.81 U/mL，比原菌株提高了34.72倍。值得注意的是，尽管存在其他蛋白质杂质，但在FM22培养基中产生的总蛋白质含量达到5.41±0.1 g/L，比原菌株增加了27.05倍。FM22培养基的成分与BSM相似，是酵母发酵的常用培养基之一。而FM22介质不含磷酸，不需要加入大量的氨溶液来调节pH值，易于操作。因此，可以考虑使用FM22培养基制备接种物。
 

图4. CALB重组菌株在FM22培养基中的发酵图谱

#4   重组CALB催化地沟油制备生物柴油

科研人员通过实验确定了重组CALB催化地沟油制备生物柴油的最佳工艺条件为:甲醇/油比5:1，酶投加量20 U/g油，水含量(V/V) 20%，反应温度30℃。在此条件下反应60 h后，生物柴油的产率为66.54±0.11%，成功完成了从地沟油向生物柴油的转化，为利用重组CALB作为催化剂将含有大量游离脂肪酸的废弃或低质量生物油原料转化为生物柴油提供了一条极具前景的途径
 

参考文献：Xiao, D. ,  Li, X. ,  Zhang, Y. , &  Wang, F. . (2023). Efficient expression of candida antarctica lipase b in pichia pastoris and its application in biodiesel production. Applied biochemistry and biotechnology.

 

文献中提到的1.3L生物反应器是来自迪必尔生物的Minibox 5平行生物反应器（图5）。迪必尔平行生物反应器从最初的minibox 1到minibox 5，再到2021年推出第6代产品——CloudReady™云平台生物反应器，一直致力于协助合成生物学领域科学家进行科研与创新。

图5. Minibox 5 第5代平行生物反应器

 

CloudReady™云平台生物反应器（图6）整合了多种补料策略，同时内置DoE实验设计与分析软件可以帮助用户快速的进行布局实验，缩短产品的开发周期。

图6. CloudReady™ 第6代平行生物反应器