高密度微载体灌流工具助力Vero细胞高密度灌流培养及消化转移工艺验证
Vero细胞是生物医药领域中制备病毒载体和疫苗最常用的细胞系，基于微载体的灌流培养工艺是较为常用的生产方式，对较高微载体投放浓度条件下灌流工艺的建立必不可缺。
本文主要利用高密度微载体灌流工具在较小体积的CloudReady™云平台生物反应器上进行Vero细胞高密度灌流培养及消化转移工艺的探索，建立缩小模型。
方法与结果
使用CloudReady™（500 mL）云平台生物反应器（图1）和自行设计的灌流装置完成Vero细胞在Cytodex 1 微载体上的高密度灌流培养。
搅拌桨叶使用多叶桨（低剪切力），搅拌方向为上扬式。
灌流工具安装于反应器内部，通过管路与外部进、出液瓶连接。
图1 CloudReady™云平台生物反应器
实验工艺参数设置如表1所示。
温度由半导体Peltier模块的加热和制冷实现无水控温。
DO由空气和氧气的通气速率级联控制。
pH由二氧化碳的通气速率和碱液（0.5 M NaOH）的流加速率级联控制。其中，进气模式均为底部通气。在完整的培养周期中，各参数控制均可靠且稳定（图2）。
图2 培养过程中温度、pH、DO参数控制稳定性
Day 3时开始以2VVD的灌流速度进行灌流，在Day 8即灌流培养5天后细胞密度达到7.82×106cells/mL，微载体上细胞密度变化如图3所示。
图3 微载体上细胞密度变化曲线
由每天取样镜检图像（图4）可见，Day 1-2时细胞在微载体上贴附较为均匀，Day 3-5细胞快速增殖铺板满微载体表面，空球率低，Day 6-8细胞在微载体上生长至较满的状态。整个培养过程中灌流装置未出现堵塞现象，细胞增殖13倍。
在培养结束时，使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 进行消化，细胞收率64%，活率100%，将收获所得细胞重新接种到原微载体上进行批次培养，细胞贴壁及增殖性能正常（图4）。
图4 每24 h及消化转移取样镜检图
本实验证实了该高密度灌流培养及逐级消化转移工艺可行性较高，为后续更高微载体投放密度及逐级放大工艺的建立提供了缩小模型的数据基础，也为实际规模化生产过程中种子细胞的批量制备提供了可尝试的方法。
图5 CloudReady™云平台生物反应器
CloudReady™云平台生物反应器（图5）应用灵活，可实现各类贴壁或悬浮细胞高密度培养，进行批次、补料、灌流等多种生物工艺的开发和优化，在较小体系中迅速建立工艺流程，助力研发效率飞速提升。
