DNA甲基化差异水平分析中的DMC、DMR、DMG鉴定
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而调控基因表达。
DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。
首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
那么甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因中的DMC、DMR、DMG怎么做呢？
一、差异甲基化位点/区域分析DMC/DMR分析
（1）DMC/DMR鉴定
ü 鉴定实验组与对照组甲基化图谱的具体差异。
ü 如果实验设计包括多个时间节点，也可以比较相邻时间节点/感兴趣的时间节点之间的甲基化图谱的差异。
DMC在基因组上的分布
（2）DMC/DMR转录因子结合分析（TF binding motif ）
主要关注Promoter和Enhancer等调控区域DMC/DMR的TF结合位点。
（3）时序甲基化数据的分析策略（Time Course）
l 比较相邻时间点的差异
l 直接筛选时间阶段相关的DMC和DMR
ü 线性模型/混合线性模型
（可以排除混杂因素干扰，如性别）
l 共甲基化模式分析(阶段特异性Cluster筛选)
ü WGCNA（权重基因共表达网络分析）
ü MEGENA（多尺度嵌入式基因共表达网络分析）
ü mfuzz
ü ... ...
（4）DMC/DMR在基因元件上的分布
二、差异甲基化基因（DMG)的功能分析
将有至少一个 DMR 注释到其 promoter 或 genebody 的基因称之为差异甲基化基因。 有研究表明 promoter 区域甲基化提高具有潜在抑制基因转录的功能；而 genebody 区域 与表达具有正相关关系。所以研究这两个区域发生差异甲基化的基因，可以帮助我们研 究受甲基化调控的细胞功能的变化规律。
分析策略：
三、易基因差异甲基化水平检测
（1）差异甲基化区域（DMR）检测
DMR检测使用权威期刊发表的metilene 软件，该软件利用二元分隔算法（binary segmentation algorithm）结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），可快速实现成对样本或两组样品间的DMR 重头检测(de novo)。最后，通过多重检验校正，进而得到差异甲基化区域。使用CpG 位点来寻找差异甲基化区域。
DMR 检测规则：
（2）差异甲基化区域（DMR）的注释
将 DMR 分别注释到genebody和 promoter 区。
表1：DMR 注释结果（部分）
（3）差异性甲基化基因（DMG）的功能分析
GO、KEGG 富集分析。为了研究DMG的功能，采用超几何分布检验（Hypergeometric distribution test）分析 DMG在GO term和KEGG pathway中的富集情况。
（4）差异性甲基化区域（DMR）的可视化
由于DMR 数量太多，筛选 Q-value top20 的差异甲基化区域进行可视化绘图。下图为例，黄色部分为 DMR 区域。横坐标以绘出以 DMR 区域为中心向两侧各扩展 1kb 区域的甲基化情况。最上方黑色方框标识出该区域内基因 promoter 区的位置（如果有）和基因表达方向。中间部分是两组样本的甲基化水平变化曲线。最下方是 CG 位点密度曲线。
DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。
首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。
其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。
最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。
那么甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因中的DMC、DMR、DMG怎么做呢？
一、差异甲基化位点/区域分析DMC/DMR分析
（1）DMC/DMR鉴定
- 差异甲基化位点：DMC
- 差异甲基化区域：DMR
ü 鉴定实验组与对照组甲基化图谱的具体差异。
ü 如果实验设计包括多个时间节点，也可以比较相邻时间节点/感兴趣的时间节点之间的甲基化图谱的差异。
DMC在基因组上的分布
DMR在基因组上的分布
（2）DMC/DMR转录因子结合分析（TF binding motif ）
主要关注Promoter和Enhancer等调控区域DMC/DMR的TF结合位点。
l 比较相邻时间点的差异
l 直接筛选时间阶段相关的DMC和DMR
ü 线性模型/混合线性模型
（可以排除混杂因素干扰，如性别）
l 共甲基化模式分析(阶段特异性Cluster筛选)
ü WGCNA（权重基因共表达网络分析）
ü MEGENA（多尺度嵌入式基因共表达网络分析）
ü mfuzz
ü ... ...
（4）DMC/DMR在基因元件上的分布- TE（转座元件）：影响基因组稳定性
- Promoter：影响基因表达
- Genebody
二、差异甲基化基因（DMG)的功能分析
将有至少一个 DMR 注释到其 promoter 或 genebody 的基因称之为差异甲基化基因。 有研究表明 promoter 区域甲基化提高具有潜在抑制基因转录的功能；而 genebody 区域 与表达具有正相关关系。所以研究这两个区域发生差异甲基化的基因，可以帮助我们研 究受甲基化调控的细胞功能的变化规律。
分析策略：
- 可以分为Hyper-DMG和Hypo-DMG
- 可以分为Promoter-DMG和Genebody-DMG
- Gene Ontology
- KEGG pathway
- Reactome pathway
- DisGeNET disease
- Disease Ontology
三、易基因差异甲基化水平检测
（1）差异甲基化区域（DMR）检测
DMR检测使用权威期刊发表的metilene 软件，该软件利用二元分隔算法（binary segmentation algorithm）结合双重统计学检验（MWU-test和2D KS-test），可快速实现成对样本或两组样品间的DMR 重头检测(de novo)。最后，通过多重检验校正，进而得到差异甲基化区域。使用CpG 位点来寻找差异甲基化区域。
DMR 检测规则：
- 每个CpG 位点测序深度>=5x;
- CpG 位点的甲基化差异>=0.2;
- 该区域的差异甲基化 CpG 位点个数>=5;
- 相邻差异甲基化CpG 位点的距离<=300bp;
- MWU-test p-value < 0.05。
（2）差异甲基化区域（DMR）的注释
将 DMR 分别注释到genebody和 promoter 区。
表1：DMR 注释结果（部分）
（3）差异性甲基化基因（DMG）的功能分析
GO、KEGG 富集分析。为了研究DMG的功能，采用超几何分布检验（Hypergeometric distribution test）分析 DMG在GO term和KEGG pathway中的富集情况。
（4）差异性甲基化区域（DMR）的可视化
由于DMR 数量太多，筛选 Q-value top20 的差异甲基化区域进行可视化绘图。下图为例，黄色部分为 DMR 区域。横坐标以绘出以 DMR 区域为中心向两侧各扩展 1kb 区域的甲基化情况。最上方黑色方框标识出该区域内基因 promoter 区的位置（如果有）和基因表达方向。中间部分是两组样本的甲基化水平变化曲线。最下方是 CG 位点密度曲线。
图： 组间 DMR 差异甲基化曲线
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