生物反应器在一锅法体外合成藏红花酸中的应用

 

藏红花酸（crocetin）是藏红花的主要活性成分之一，在中草药、食用色素和染料工业中有着广泛的应用。

研究表明，藏红花酸及其衍生物有益于治疗多种疾病，包括癌症、冠心病和高血压。目前，藏红花酸可从藏红花柱头和栀子中提取、分离和纯化，然而藏红花年产量低、种植成本高(1公斤藏红花的成本约为200美元)，同时，藏红花中藏红花酸等天然化合物的含量通常较低，这也导致了传统提取和纯化工艺的高成本。

幸运的是，上述问题可以通过生物合成技术的发展来解决，但从头生物合成实现藏红花酸的商业化生产仍有很长的路要走，目前迫切需要一种更有效和可持续的生物合成藏红花酸及其类似物的策略。

 

近日，来自天津大学的肖文海老师课题组在《ACS Sustainable Chemistry Engineering》发表了主题为“One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System”的研究论文，首次创建了藏红花酸的一锅法体外合成方式。
 

通过优化的蛋白表达和反应系统，以及类胡萝卜素裂解双加氧酶2(CsCCD2-M1 (R192F/S323A))和醛脱氢酶(SynALD)组成的双酶系统，从玉米黄质中生物合成藏红花酸。但是由于CsCCD2-M1和SynALD活性失衡，导致副产物3-HACA（3-hydroxy-β-apo-8′-carotenoic acid）的严重积累。研究人员进一步通过以6∶1的摩尔比和优化的双酶反应条件，完全去除了副产物3-HACA。最终将优化后的体系放大10000倍后，在台式生物反应器（迪必尔生物）中进行藏红花酸的放大合成，结果显示藏红花酸的生物合成效率为1.48 mg/L/h, 2h内转化率为80.8%。此外，经过三次循环后，残余酶系统仍保留34%以上的酶活性。本研究不仅提供了一种可持续的体外生产藏红花酸的方法，而且为快速构建一锅法合成具有复杂结构的高价值化合物提供了新的思路。

 

具体的实验研究路线为：

1）CsCCD2-M1和SynALD表达系统的建立

 

温度和诱导剂浓度是对蛋白可溶性表达的两个关键因素，研究人员首先测试了CsCCD2-M1和SynALD在不同诱导温度和诱导剂浓度下的表达，结果如图1所示，表达CsCCD2-M1和SynALD的最佳IPTG浓度和温度分别为0.1μM和16℃。分子伴侣的主要功能是防止新合成的多肽链和组装的亚基聚集形成非功能结构。同时，分子伴侣还参与蛋白质的转运、错误折叠的降解和蛋白质聚集的抑制，它在维持细胞内蛋白稳态中起着至关重要的作用。因此，研究人员尝试将伴侣质粒pGRO7与CsCCD2-M1和SynALD共表达，以提高它们的可溶性表达。如图2a、b SDS-PAGE结果所示，分子伴侣蛋白的共表达显著提高了CsCCD2-M1和SynALD的可溶性表达。最终，在诱导温度为16℃、诱导剂浓度为0.1μM、添加分子伴侣的条件下，能够有效地增强了蛋白的可溶性表达。
 

图1 诱导剂浓度和诱导温度对蛋白表达的影响

（a）不同浓度的IPTG对于CsCCD2-M1表达的影响

（b）不同温度对于CsCCD2-M1表达的影响

（c）不同浓度的IPTG对于SynALD表达的影响

（d）不同温度对于SynALD表达的影响

 

图2 分子伴侣pGRO7对CsCCD2-M1和SynALD表达的影响

 

2）CsCCD2-M1催化条件的优化

 

pH和反应温度是酶反应过程中的两个重要因素，此外，Fe2+也是CsCCD2-M1催化活性中心的重要组成部分。因此研究人员通过调节pH、温度和FeSO4的浓度来优化CsCCD2-M1的反应条件。向反应系统中加入5μM的玉米黄质，在不同的反应条件下反应2h，通过反应前后玉米黄质含量的变化来确定玉米黄质的转化率。从图3（b、c、d）中可以看出在30℃、pH 8.0和0.3μM Fe2+的添加量的条件下，藏红花酸二醛的收获率最高，同时将其确定为后续实验的实验条件。
 

图3 一锅法合成途径中CsCCD2-M1催化条件的优化

（a）以玉米黄质为底物的CsCCD2-M1反应途径

（b）pH对CsCCD2-M1活性的影响，实验温度为30℃

（c）温度对CsCCD2-M1活性的影响，实验pH为8.0

（d）铁离子对CsCCD2-M1活性的影响，实验温度和pH分别为30℃、8.0

 

3）用于一锅法合成的CsCCD2-M1/SynALD双酶调控模式

 

从玉米黄质到藏红花酸的生物合成途径中最主要的两步分别由CCD2和ALD催化完成。为了建立两步反应体系和确定最佳的底物-酶的添加比，研究人员在200μL的反应体系中，加入5μM的玉米黄质，然后添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，深入分析反应6h内底物和产物的变化。如图4(a)所示，玉米黄质被快速消耗，藏红花酸和副产物3-HACA不断积累；中间产物3-HAC也有少量积累，但随即被迅速转化。反应2h后，底物玉米黄质和中间产物3-HAC被完全消耗，反应体系中只有最终产物藏红花酸和副产物3-HACA，大约有17%的副产物未被转化。然后，研究人员通过分析CCD2和ALD的作用机制，推导出如图4（b）所示的反应途径，并进行了相应验证，最终分析副产物的产生可能是由于两酶的催化活性不对等所致，并进一步评估了CsCCD2-M1和SynALD的相对酶活性，如图4（c）所示，SynALD的催化效率是CsCCD2-M1的6倍。当CsCCD2-M1和SynALD以6:1的摩尔比加入时，3-HACA在2小时内被消除(图4d)。
 

图4 藏红花酸合成的最佳酶添加比

（a）以5μM的玉米黄质为底物，添加1μM的CsCCD2-M1和SynALD，6h内的反应过程

（b）以玉米黄质为底物体外合成藏红花酸的过程

（c）顺序添加1 μM的CsCCD2-M1和以5 μM玉米黄质为底物的SynALD反应过程。

（b）以5 μM玉米黄质为底物，加入1 μM CsCCD2-M1和0.17 μM SynALD, 6 h内的反应过程。

 

4）一锅法合成藏红花酸的放大

 

基于上述优化体系，研究人员将反应体系放大100倍。在该反应体系中，为了避免副产物3-HACA的产生，CsCCD2-M1和SynALD的添加比为6：1，最终计算出藏红花酸的转化率约为80.7%（图5 b）。同时，为了降低反应成本，提高酶在反应体系中的利用率，研究人员将酶反复收集并利用（图5 a），并对回收的酶进行了活性检测，如图5b、c、d所示，三轮反应中藏红花酸的转化率分别为80.7%、58.1%和34.1%。

   
为了进一步实现藏红花酸的大规模生产，研究人员将反应体系扩大到10000倍至2.0L（图6），并对目标产物藏红花酸进行了分离、定量和表征。最终获得5.92mg的藏红花酸，其纯度可达99%，且藏红花酸的转化率为80.8%，制备回收率为76.3%。

 

图5 一锅法合成藏红花酸的多轮放大

（a）酶在反应体系中回收的操作流程示意图

（b-d）三轮以玉米黄质为底物合成藏红花酸的反应

（e）藏红花酸的LC-MS及1H NMR检测结果

 

图6 藏红花酸在台式反应器（迪必尔生物）的放大合成

参考文献：

Mengying Shan, Mingdong Yao, Ying Wang, Wenhai Xiao, and Ying-jin Yuan. One-Pot Efficient Bioconversion of Crocetin from Zeaxanthin via a Dual-Enzyme System. ACS Sustainable Chemistry & Engineering 2023 11 (23), 8615-8623