单细胞转录组测序在小鼠大脑中的神经炎性星形胶质细胞亚型研究的应用
期刊： Nature neuroscience（IF 28.77）
测序技术：单细胞转录组测序，空间转录组测序
导语
使用脂多糖研究小鼠皮质星形胶质细胞在急性炎症刺激后的转录组变化。发现星形胶质细胞的转录组变化发生在数小时内，随着时间的推移急剧变化。通过对约80000个星形胶质细胞进行单细胞测序，发现炎症引起广谱的反应，亚型星形胶质细胞经历了不同的炎症转变，并具有明确的转录组特征。利用转空间录组学将炎症诱导的反应性星形胶质细胞的关键亚状态定位于大脑区域。
方法
注射LPS诱导小鼠急性炎症模型，注射3h、24h和72h，小鼠皮质分选星形胶质细胞，进行RNA-seq；注射24h及对照小鼠皮层分选星形胶质细胞，进行scRNA-seq和空间转录组测序。
结论
星形胶质细胞会在生物体感染、急性损伤和慢性神经退行性疾病中发生炎症转化。本文中，研究者通过使用脂多糖诱导小鼠急性炎症，并对小鼠皮质星形胶质细胞的转录组进行分析。结果显示星形胶质细胞在数小时内转录组发生了明显的变化。星形胶质细胞亚型经历了不同的炎症转变，各亚型具有明确的转录组图谱。研究者还利用空间转录组学将炎症诱导的反应性星形胶质细胞的关键亚状态定位于特定的大脑区域。本研究为星形胶质细胞的异质性提供了重要的理论基础，并将有助于理解区域受限反应性星形胶质细胞亚状态的生物学重要性。
实验思路
研究结果
1. 随着时间的推移，星形胶质细胞获得不同的炎症状态
研究星形胶质细胞时间依赖性转录组对炎症的变化，研究者在出生后第30-35天（P30-35）向Aldh1l1eGFP报告小鼠腹腔注射LPS或无内毒素盐水作为对照。注射LPS后3、24和72小时，对皮质星形胶质细胞进行荧光活化细胞分选纯化，提取总RNA并处理以获得大量RNA序列（图1a）。研究者发现星形胶质细胞基因表达在3小时、24小时和72小时发生了广泛变化（图1b，c）。24小时的反应与之前发表的反应相似，常见的星形胶质细胞反应性标记物Gfap和Serpina3n在所有时间点都上调（图1e）。然而，研究者发现，基因表达的变化大多是单个时间点独有的（图1d），在所有时间点，743个改变的基因中只有4%被诱导。例如，干扰素刺激基因（ISG）如IIgp1、Cxcl10和Gbp2在3小时时表达最高（图1e、f）。在24小时，参与血管生成和血压的基因如Fbln5、Agt和参与细胞外基质重塑的基因（包括Timp1）上调（图1e、f）。
2. 复杂的星形细胞亚群分布在大脑中不同的区域
为了进一步了解星形胶质细胞的异质性，研究者接下来对来自注射LPS和盐水的雄性和雌性Aldh1l1eGFP小鼠的星形胶质细胞进行scRNA-seq（图2a）。使用细胞类型标记去除非星形细胞后，共保留79,944个细胞，鉴定到10个细胞类群(图2b,c)，这些亚群可分为灰质/上层富集(亚群0、1、3和8)或白质/深层/次皮层(亚群 2、4、5、6、7和9)。为了确定研究者的星形胶质细胞亚群是否占据不同的解剖位置，研究者对3只盐水处理小鼠和3只LPS处理小鼠大脑切片进行了空间转录组分析。通过星形胶质细胞特异性基因，如S100b或Aldh1l1的空间表达，结合单细胞转录组数据，确定了各细胞群的空间位置。
3. 星形胶质细胞对炎症的反应是异质性的
为了了解单个集群对LPS诱导的炎症的反应，研究者对各个亚群分别进行了差异分析。研究者观察到，所有集群对LPS诱导的炎症反应强烈（图3b-d）。尽管大多数星形胶质细胞表现出重叠的基因诱导，但不同的亚群产生不同的炎症反应（图3c、d）。研究者发现每个亚群都有独特的诱导基因，其中亚群4具有最多的亚群特异性DEG（图3c）。然而，大多数基因在集群之间表现出复杂的协同调节，在9个集群中常见45个DEG（图3c）。当观察LPS诱导基因的亚群富集时，研究者再次观察到炎症基因的亚群特异性表达。例如，亚群8富含ISG，如Igtp、Tap1和Stat1。同时，亚群7诱导参与血管生成的基因，包括Agt、Cd34、Fbln5和Pgf。
4. 星形胶质细胞的反应亚群占据不同的解剖位置
亚群4占所有测序星形胶质细胞的5.9%，主要由炎症标记物定义，包括Timp1、Gap43、Hspb1、Lcn2和Gfap。亚群4还表达通常由干扰素诱导的基因，包括Psmb8、Ifitm3和参与抗原呈递的基因：H2-K1、H2-T23和H2-D1（图4a–c）。研究者发现，在盐水和LPS处理的动物中，第4亚群细胞存在于Gfap+白质束中，包括胼胝体，以及第三脑室和侧脑室之间（图2d和4d）。尽管亚群4在对照和炎症小鼠大脑中被鉴定，受LPS诱导表达上述炎症基因（图3）。当探测亚群4基因模块时，研究者发现LPS处理在所有Visium脑切片中都有强大的诱导作用（图4e）。
与亚群4不同，亚群8对LPS表现出强烈的早期反应，是唯一一个几乎完全存在于LPS处理的小鼠中的亚群（图第5a、d）。亚群8表达的基因中的大多数是ISG，包括IFN依赖性转录的主要调节因子Stat1和Stat2。在亚群8中富集的其他基因包括参与抗原处理（Tap1和Tap2）和呈递（H2-Q4、H2-K1、H2-Ab1、H2-D1和H2-T23）以及IFN诱导的GTP酶（Gbp3、Gbp7、Gbp2、Irgm1、Iigp1和Igtp）的基因（图5b、c），提示这些星形胶质细胞暴露于干扰素，并使其抗原呈递能力增加。空间转录组学显示Cluster 8位于小鼠大脑的侧脑室和第三脑室周围、海马下方以及脑表面。
5. 疾病模型中的干扰素反应性星形胶质细胞
鉴于其明确的炎症特征，在明确炎症特征的基础上，研究者将本文的研究数据与前人发表的来自阿尔茨海默病小鼠模型、多发性硬化(MS)小鼠模型和急性刺伤模型的scRNA-seq数据集整合在一起分析，以期进一步探讨亚群8是否存在于其他具有炎症成分的疾病模型中。以上数据集单独分析时，没有发现8亚群星形胶质细胞，可能是因为这些研究中亚群8星形胶质细胞的占比较低(~2.7%)。而当所有数据集整合分析时，在人类疾病的慢性小鼠模型中，研究者发现星形胶质细胞表达亚群8基因，其表达部分依赖于Trem2（图6a–c）。最后，在刺伤损伤的小鼠模型中也可以发现第亚群8星形胶质细胞（图6g–i）。这些整合实验提供了一种可能性，即尽管星形胶质细胞在单一损伤（例如LPS诱导的炎症）内的反应存在异质性，但在几种条件下，反应性星形胶质细胞的特定亚状态存在一定的同质性。
参考文献：
Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., & Liddelow, S. A. (2021). Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nature neuroscience, 24(10), 1475–1487. https://doi.org/10.1038/s41593-021-00905-6
