文献解读：MMP21杂合子变异与中国汉族儿童可遗传内脏异位综合征相关
期刊：Human Genomics：6.48分
测序技术：WES（外显子测序）-伯豪合作文章
在81名患童中选取的25名作为筛选队列(30.9%)进行外显子测序(表1)。本文总共识别了28种错误的致病性(或可能的)变异，其中11个已知的基因突变和HTX 相关，包括：DNAH5, DNAI1, GALNT11, MEGF8, MMP21, NODAL, NPHP4, PKD1L1, ROCK2, SHROOM3, SMAD2 。
此外，三个罕见MMP21杂合子错义突变在三个不相关的中国汉族患者中被发现，具体的突变情况以及心脏畸形的部位：p.G244E-右位心脏；p.L277F-右位心脏且右心房异构；p.K487E-右心房异构(表2)。
通过Sanger测序，把患童MMP21基因的突变位点和他们的双亲进行对比(图，1A)。而这三个MMP21的基因突变位点主要分布在3号外显子和7号外显子(图，1B)。在对应的氨基酸序列来看，突变的区域在锌依赖性MMP催化域(ZnMC_MMP) 和血红素样重复序列(HX超家族) (图，1C)。这些氨基酸取代位点在多种脊椎动物中高度保守，如(图1D)所示，MMP21蛋白的氨基酸序列比对中使用Clustal X软件，这也说明突变导致的氨基酸取代可能导致MMP21蛋白功能的改变。为了进一步研究变异的功能效应，我们使用SWISS-MODEL构建了WT和突变MMP21蛋白的三维结构(图1E)。
2. MMP21的突变不影响其本身的表达
为了进一步探索MMP21突变对其本身表达的影响，本文构建了MMP21突变的HEK293T细胞株，除了空白质粒载体，还分别构建质粒：pCMV3-MMP21-mut1 (p.G244E)；pCMV3- MMP21-mut2 (p.L277F)；pCMV3-MMP21-mut3 (p.K487E)。采取单独突变转染和共转染(WT/mutant=1:1)两种方式，并进行RT-qPCR检测，结果显示单独或是共转染的方式都不影响MMP21转录水平的改变。通过Western blot进行检测，结果显示MMP21突变在蛋白水平也没有显著影响，虽然在单独转染Mut3蛋白有一定的下调但是统计没有显著性差异(p=0.0529)。(图2)
3. 突变的MMP21 mRNA c.731G>A (mut1) 和c.1459A>G (mut3) 未能逆转SB - MO敲低MMP21引起的斑马鱼心环紊乱
为了研究确定的突变是否影响MMP21蛋白功能及其在左右轴向发育中的作用，通过SB-MO微注射构建了MMP21敲降斑马鱼模型。通过显微注射构建模型，前期还通过不同的浓度做了预实验，RT-qPCR结果表明对照MO和SB-MO(splice-blocking Morpholino oligo)的1.0 mM注射浓度下，有效阻断斑马鱼中MMP21的剪接。(图3A)。
利用clmc2的反义链RNA设计探针所谓斑马鱼心内心管的标记物，通过原位杂交判断心脏的位置。基于受精孵育48h (48hfp)的胚胎进行对比，发现WT组或者处理对照组心脏循环的方向在右方(D-loop)，但是SB-MO组的心脏循环更多是不正常的状态，比如L-loop或者没有循环，甚至会出现尾部畸形或者脊柱弯曲。(图3B)。
4. WT&Mut1(c.731G>A)和WT&Mut3(c.1459A>G)杂合子MMP21 mRNA不能完全逆转 mmp21引起的心环异常
在MMP21敲降斑马鱼中，再分别显微注射，wtMMP、Mut1MMP(c.731G>A: p.G244E)、Mut2MMP(c.829C>T: p.L277F)、Mut3MMP(c.1459A>G: p.K487E)对应的mRNA,观察胚胎心脏畸形是否改善。结果显示当注射正常wtMMP时候，可以有效减少斑马鱼胚胎畸形的概率(13.63% vs. 2.51%, p<0.0001)。不同的突变体进行对比发现，Mut1MMP和Mut3MMP的逆转胚胎畸形的效果不如正常wtMMP的结果,另一方面Mut2的逆转效果比较好，并且和wtMMP的结果比较接近。(图4A，B)同时设计混合共注射分组（WT：mutant mRNAs = 1:1），模拟杂合子的情况，结果显示混合后畸形率有了很大的改善，但是仍然高于wtMMP组。(WT&Mut1: 25.06% vs. WT: 13.76%, p<0.0001；WT&Mut3: 22.32% vs. WT: 13.76%, p=0.0008)。这些结果表明，p.G244E和p.K487E可能具有显性负效应，并增加异常左右模式的易感性。支持它们的功能和临床相关性。
参考文献：
Qin XJ, Xu MM, Ye JJ, et al. De novo disruptive heterozygous MMP21 variants are potential predisposing genetic risk factors in Chinese Han heterotaxy children. Hum Genomics. 2022;16(1):41. Published 2022 Sep 19. doi:10.1186/s40246-022-00409-9
