文献解读：人类乳腺正常、癌前和致瘤状态的单细胞RNA表达图谱
期刊：EMBO J（IF=14.012）
技术：scRNA-seq
导语
为了检测乳腺异质性在不同状态下的整体变化，对34种未经治疗的原发肿瘤(包括雌激素受体(ER)+、HER2+和三阴性乳腺癌)的scRNA-seq分析显示，癌细胞和循环细胞的离散亚群之间具有相当的多样性。
在肿瘤免疫领域，增生性CD8+ T细胞是三阴性和HER2+癌症的特征，而不是ER+肿瘤，而所有亚型都包含循环肿瘤相关的巨噬细胞，因此调用了潜在的不同的免疫治疗靶点。配对的ER+肿瘤和淋巴结的拷贝数分析表明，由基因不同的克隆播种或原发肿瘤细胞大规模迁移到腋窝淋巴结。这种大规模的患者样本整合提供了正常和癌变人类乳腺细胞多样性的高分辨率图谱。
研究结果
1. 以高分辨率绘制肿瘤和正常乳腺组织的细胞多样性
对来自55名患者的69个不同的手术组织标本构建了scRNA-seq文库，获得了近43万个单个细胞的表达谱。上皮细胞根据CD49f和CD326表达进行分类。先前的细胞分选揭示了三种明确的上皮细胞簇，分别对应于基底细胞、腔内祖细胞(LP)和成熟腔内细胞(ML)。移除基质亚群，并重新整合11例患者的剩余细胞。绝经前(n = 8)和绝经后(n = 3)女性的比较根据激素状态显示相似的聚类分布。重新聚类确认了三个主要的cluster和一个非常小的中间簇。利用细胞分选和RNA-seq技术鉴定基底、LP和ML细胞群的表达特征，然后，根据每个细胞表达的基础、LP或ML特征基因的比例，将每个细胞定位在三元图上。然后将tSNE图中的聚类颜色叠加到三元图上，识别出基底、LP和ML群体。这些数据与X染色体失活研究以及细胞色素C氧化酶缺陷细胞的克隆跟踪研究相一致，这两项研究都表明存在双性前体细胞。
图1. 正常乳腺上皮细胞的乳腺图谱和scRNA-seq分析工作流程
2. 阐明正常乳房微环境和伴随激素状态的变化
通过分析从绝经前(n = 8)和绝经后(n = 5)女性减容乳房成形术中分离出来的总组织细胞，研究了正常乳腺组织的免疫和基质微环境。经过质量筛选后，scRNA-seq分析得到54,332个细胞的表达谱。单细胞表达谱的整合和聚类产生了8个主要的cluster。EPCAM表达显示其中3个cluster为上皮细胞。为了进一步探究导管微环境中细胞的身份，将EPCAM+上皮细胞移除，剩余细胞重新聚集，从而产生7个非上皮细胞的cluster。伪体样本的差异表达分析为每个cluster选择了标记基因，确定了细胞类型。与人类乳房的纤维和血管性质一致，成纤维细胞、内皮细胞和周细胞构成了主要部分。绝经前和绝经后组织微环境中的组织常驻细胞表现出一些差异。在绝经后组织中，成纤维细胞和血管内皮细胞的比例分别较低和较高。尽管患者间存在差异，但绝经前和绝经后微环境之间的细胞类型组成差异具有统计学意义。
图2. 绝经后乳腺组织微环境的转录变化
3. 绝经后乳腺组织中上皮相关成纤维细胞的变化
除某些髓系marker外，大多数免疫亚群的几个决定性细胞标记物在绝经前和绝经后组织之间的表达相似。在成纤维细胞中，基质相关基因的细胞比例较低。乳腺组织的高分辨率共聚焦成像显示，绝经后组织中PDGFRb+成纤维细胞的表达和空间分布显著减少。将绝经前和绝经后妇女的细胞重新聚类，在这5个cluster中，有3个cluster在所有激素环境下的标本中都是常见的。KEGG通路分析显示cluster1富含免疫调节信号通路。顶部标记基因表达分析显示，cluster 1中基质金属蛋白酶和趋化因子表达丰富。cluster2的特征是与立即早期反应相关的转录因子和DNA损伤基因的表达相关。
图2. 绝经后乳腺组织微环境的转录变化
4. BRCA1突变携带者癌前组织分析
对4名BRCA1突变携带者的预防性乳房切除术(病理正常)中获得组织进行scRNA-seq分析，与图2A中的8个正常(WT)绝经前合并分析，生成了包含59,766个乳腺细胞的联合t-SNE图。正常组织和癌前组织中不同簇的比例相似(P = 0.14)。对4例BRCA1突变TNBC肿瘤患者，与先前确定的瘤前病变谱进行整合，聚类发现13个cluster。
图4. 正常组织、BRCA1+/-癌前组织和BRCA1相关肿瘤的scRNA-seq比较
5. BRCA1+/-癌前组织与肿瘤的微环境改变
去除正常和肿瘤上皮细胞后，微环境中的细胞重新聚类，产生9个cluster。肿瘤与癌前组织的微环境有明显的实质性变化，两组患者的cluster分布不均匀。基质细胞和血管细胞所占比例较小，这可能反映了肿瘤浸润免疫细胞的转移。个体患者之间的cluster比例有相当大的差异。在BRCA1相关肿瘤中明显存在大量TIL人群。Treg细胞在肿瘤中显著，而在癌前组织中检测不到。在不同患者样本的基质和免疫组成中观察到的巨大差异不仅反映了固有的组织多样性，还反映了其他参数，包括病理标本在整个肿瘤/组织中的位置，组织收集和处理之间的时间，以及用于分离不同细胞类型的精确消化方案。
图5. BRCA1+/-癌前组织与肿瘤的微环境改变
6. 乳腺癌主要亚型之间的肿瘤异质性
CNV分析用于区分正常和恶性上皮细胞，在HER2+和ER+标本中检测到正常上皮cluster。每个肿瘤亚型都包含两个突出的EPCAM+。所有亚型都包含一个离散的循环MKI67+肿瘤细胞簇，但这在TNBC中最为普遍。TNBC中的MKI67+亚群在ESR1和PGR中呈阴性，而在HER2+肿瘤中，两个cluster都表达ERBB2+和ESR1。ER+肿瘤的KEGG通路分析显示，cluster1中雌激素和类固醇信号通路富集，cluster2中DNA复制和修复通路富集。
图6. 乳腺癌主要亚型之间的肿瘤异质性
7. 不同乳腺肿瘤亚型微环境的反卷积
微环境中的主要的cluster是根据谱系特异性基因的表达来确定的。伪体样本的热图显示了每个cluster的marker基因。通过伪体读计数的差异表达分析，确定每个cluster的前30个marker基因。
图7. 不同乳腺肿瘤亚型微环境的反卷积
8. 分析原发肿瘤和浸润淋巴结的scRNA-seq，可以确定肿瘤细胞的克隆繁殖
结合7例ER+患者匹配的肿瘤和淋巴结样本的t-SNE图。显示了根据原发肿瘤或受累淋巴结细胞(黄色)标记的合并细胞。绘制每条染色体的拷贝数变异(CNV)。通过CNV丰度可以将肿瘤细胞与正常(N)细胞区分开。
图8. 分析原发肿瘤和浸润淋巴结的scRNA-seq，可以确定肿瘤细胞的克隆繁殖
参考文献：
Pal B, Chen Y, Vaillant F, Capaldo BD, Joyce R, Song X, Bryant VL, Penington JS, Di Stefano L, Tubau Ribera N, Wilcox S, Mann GB; kConFab; Papenfuss AT, Lindeman GJ, Smyth GK, Visvader JE. A single-cell RNA expression atlas of normal, preneoplastic and tumorigenic states in the human breast. EMBO J. 2021 Jun 1;40(11):e107333. doi: 10.15252/embj.2020pub 2021 May 5. PMID: 33950524; PMCID: PMC8167363.
